Name: immunostaining of dissected zebrafish embryonic heart
Uploaded: 2012-01-10T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart at JoVE.com

Vi takker Beninio Jomok for hans hjelp i sebrafisk underhaldande. Dette arbeidet er finansiert av NIH HL81753.

1. Utarbeidelse av lysbilder og fuktet kammer <ol><li> Den fuktet kammer kan gjøres fra en boks som en tømt tips boks. Pakk både kammer og dekk med aluminiumsfolie for å beskytte prøvene mot lys. </li><li> Inne i kammeret, satt en haug med vått tørkepapir til å opprettholde fuktigheten i kammeret, noe som vil hindre hjertet prøvene fra tørking. Sett en liten mikroplate på toppen av papir håndkle som et rack for lysbildene. </li><li> Tegn enten linjer eller sirkler på overflaten av et objektglass med immEd...

<ol>
	<li>Shin, J. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Zebrafish+to+human:+modular+medical+models.">From Zebrafish to human: modular medical models.</a> Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).</li><li>Beis, D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+biology:+following+the+zebrafish+trend.">In vivo cell biology: following the zebrafish trend.</a> Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).</li><li>Schoenebeck, J. J., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cardiac+development:+Advances+in+imaging+add+new+dimensions+to+the+utility+of+zebrafish+genetics.">Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+the+genetic+basis+of+cardiovascular+disease.">Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease.</a> Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).</li><li>Huang, W., Zhang, R., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibrillogenesis+in+the+developing+zebrafish+heart:+A+functional+study+of+tnnt2.">Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2.</a> Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (2007).</li><li>Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle:+the+regulation+of+myogenesis.">Muscle: the regulation of myogenesis.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 745-751 (1994).</li><li>Wheelock, M. J., Knudsen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherins+and+associated+proteins.">Cadherins and associated proteins.</a> Vivo. 5, 505-513 (1991).</li><li>Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+hypertrophy+involves+both+myocyte+hypertrophy+and+hyperplasia+in+anemic+zebrafish.">Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish.</a> PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).</li><li>Auman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+modulation+of+cardiac+form+through+regionally+confined+cell+shape+changes.">Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes.</a> PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).</li><li>Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+zebrafish+essential+and+regulatory+myosin+light+chains+reduces+cardiac+function+through+distinct+mechanisms.">Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms.</a> Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).</li></ol>

Sammenlignet med klassiske hele montere farging metoder, har vår metode følgende fordeler. Først kan mye sterkere fluorescerende signalene være konsekvent oppnådd takket være forbedret penetrasjon. I hele montere farging metoden, den tette huden vev rundt hjertet betydelig redusert inntrengning av mange antistoffer, som resulterer i høy bakgrunn i hele kroppen. Dette problemet er spesielt alvorlig for fostre eldre enn 3-dagers post-fertilisering (DPF). I kontrast, det dissekert hjerter bare bestå av noen få cel...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Forskning organiske </td><td> 3007T </td></tr><tr><td> Formaldehyd </td><td> Polysciences </td><td> 04018 </td></tr><tr><td> Insulin sprøyte </td><td> Becton Dickinson </td><td> 329461 </td></tr><tr><td> Triton-X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8532 </td></tr><tr><td> Anti-β-catenin antistoff </td><td> Sigma </td><td> C7207 </td></tr><tr><td> Anti-Mef2c antistoff </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> SC313 </td></tr><tr><td> F59 </td><td> Zfin </td><td></td></tr><tr><td> Anti-α-actinin antistoff </td><td> Sigma </td><td> A7811 </td></tr><tr><td> Anti-ilk antistoff </td><td> Cellesignalisering </td><td> # 3862 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 Goat anti kanin IgG </<html> td&gt; <td> Invitrogen </td><td> A11011 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Goat anti mus IgG1 </td><td> Invitrogen </td><td> A21121 </td></tr><tr><td> Montering medium for fluorescens </td><td> Vector </td><td> H-1200 </td></tr><tr><td> ImmEdge penn </td><td> Vector </td><td> H-4000 </td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin belagt lysbilder </td><td> Elektronmikroskopi vitenskaper </td><td> 63410-01 </td></tr><tr><td> Mikroskop cover glass </td><td> Fisher </td><td> 12-543-D </td></tr><tr><td> Concaved objektglass </td><td> Fisher </td><td> 7-1305-8 </td></tr><tr><td> Disseksjon mikroskop </td><td> Leica MZ95 </td><td></td></tr><tr><td> Compound mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axioplan2 </td></tr><tr><td> ApoTome </td><td> Zeiss </td><td></td></tr></tbody></table> PBST: 1 x PBS 0,5% Triton-X 100 ent &quot;&gt; 25X Tricaine: 400 mg Tricaine 97,9 mL DDH 2 O 2,1 mL (1M Tris PH9) Juster pH til 7,0

immunostaining of dissected zebrafish embryonic heart

Sebrafisk embryo blir et populært in vivo virveldyr modell for å studere hjerte utvikling og menneskets hjerte sykdommer på grunn av sin fordelaktige embryologi og genetikk 1,2. Om 100-200 embryo er lett tilgjengelig hver uke fra et enkelt par av voksen fisk. Det transparente fostre som utvikler ex utero gjør dem ideelle for å vurdere kardiale defekter 3. Uttrykket av genet kan manipuleres via morpholino teknologi eller RNA injeksjon fire. Videre framover genetiske skjermer har allerede generert en liste med mutanter som påvirker ulike perspektiver av cardiogenesis 5. Hele montere farging er en viktig teknikk i denne dyremodell å avsløre uttrykk mønster av målrettet protein til et bestemt vev 6. Imidlertid har høy oppløsning som kan avsløre mobilnettet eller subcellular strukturer vært vanskelig, hovedsakelig på grunn av fysiske location av hjertet og de fattige gjennomtrengning av antistoffer. Her presenterer vi en metode for å løse disse flaskehalsene ved å dissekere hjerte først og deretter gjennomføre misfarging prosessen på overflaten av et objektglass. For å hindre tap av lite hjerte prøver og legge til rette løsningen håndtering, vi begrenset hjertet prøvene innenfor en sirkel på overflaten av objektglass trukket av en immEdge penn. Etter flekker, kan fluorescens signalene direkte observert av et sammensatt mikroskop. Vår nye metode forbedrer penetrasjon for antistoffer, ettersom et hjerte fra en embryonisk fisk bare består av få celler lag. Bilder av høy kvalitet fra intakt hjerter kan skaffes innen en mye redusert prosesjon tid for sebrafisk embryo i alderen fra dag 2 til dag 6. Vår metode kan være potensielt utvides til stain andre organer dissekert fra enten sebrafisk eller andre små dyr.

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart at JoVE.com

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

En rask måte å utføre farging av sebrafisk embryonale hjertet er beskrevet. Sammenlignet med hele montere farging tilnærming, øker denne metoden dramatisk penetrasjon av antistoffer, som gjør skaffe høyoppløselige bilder som avslører mobil / subcellular strukturer i hjertet innenfor en mye redusert saksbehandlingstid.

Farging av dissekerte sebrafisk Embryonale Hjerte

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Et system for<em&gt; Ex vivo</em&gt; Dyrking av Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-påført skade av Sebrafisk Embryonic skjelettmuskulatur

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analyse av Embryonale og Larvesebrafisk Skeletal myofibers fra Dissosierte Forberedelser

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Metode for den embryonale mus Hjerte

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...