Name: immunostaining of dissected zebrafish embryonic heart
Uploaded: 2012-01-10T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart at JoVE.com

Vi tackar Beninio Jomok för hans hjälp i zebrafisk djurhållning. Detta arbete finansieras av NIH HL81753.

1. Beredning av diabilder och fuktig kammare <ol><li> Den fuktig kammare kan göras från en låda som en tömd tips låda. Linda både kammaren och täck med aluminiumfolie för att skydda proverna från ljus. </li><li> Inne i kammaren, sätta en hög med våta pappershanddukar för att hålla fuktigheten i kammaren, vilket kommer att förhindra att hjärtat prover från att torka. Ställ en liten mikroplattor ovanpå pappershandduk som ett rack för bilderna. </li><li> Rita antingen linjer eller cirklar på ytan av ...

<ol>
	<li>Shin, J. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Zebrafish+to+human:+modular+medical+models.">From Zebrafish to human: modular medical models.</a> Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).</li><li>Beis, D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+biology:+following+the+zebrafish+trend.">In vivo cell biology: following the zebrafish trend.</a> Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).</li><li>Schoenebeck, J. J., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cardiac+development:+Advances+in+imaging+add+new+dimensions+to+the+utility+of+zebrafish+genetics.">Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+the+genetic+basis+of+cardiovascular+disease.">Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease.</a> Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).</li><li>Huang, W., Zhang, R., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibrillogenesis+in+the+developing+zebrafish+heart:+A+functional+study+of+tnnt2.">Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2.</a> Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (2007).</li><li>Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle:+the+regulation+of+myogenesis.">Muscle: the regulation of myogenesis.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 745-751 (1994).</li><li>Wheelock, M. J., Knudsen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherins+and+associated+proteins.">Cadherins and associated proteins.</a> Vivo. 5, 505-513 (1991).</li><li>Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+hypertrophy+involves+both+myocyte+hypertrophy+and+hyperplasia+in+anemic+zebrafish.">Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish.</a> PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).</li><li>Auman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+modulation+of+cardiac+form+through+regionally+confined+cell+shape+changes.">Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes.</a> PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).</li><li>Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+zebrafish+essential+and+regulatory+myosin+light+chains+reduces+cardiac+function+through+distinct+mechanisms.">Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms.</a> Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).</li></ol>

Jämfört med klassiska hela montera immunfärgning metoder har vår metod följande fördelar. Första kan mycket starkare fluorescerande signaler konsekventa resultat tack vare förbättrad penetration. I hela berget immunfärgning metoden minskas den täta hud vävnad som omger hjärtat avsevärt penetration av många antikroppar, vilket resulterar i hög bakgrund i hela kroppen. Detta problem är särskilt allvarliga för embryon äldre än tre dagar efter befruktning (DPF). Däremot dissekerade hjärtan består av ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> tricaine </td><td> Forskning organiska </td><td> 3007T </td></tr><tr><td> Formaldehyd </td><td> Polysciences </td><td> 04.018 </td></tr><tr><td> Insulin spruta </td><td> Becton Dickinson </td><td> 329.461 </td></tr><tr><td> Triton-X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8532 </td></tr><tr><td> Anti-β-catenin antikropp </td><td> Sigma </td><td> C7207 </td></tr><tr><td> Anti-Mef2c antikropp </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> SC313 </td></tr><tr><td> F59 </td><td> Zfin </td><td></td></tr><tr><td> Anti-α-actinin antikropp </td><td> Sigma </td><td> A7811 </td></tr><tr><td> Anti-gelikar antikropp </td><td> Cellsignalering </td><td> # 3862 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 get anti kanin IgG </<html> td&gt; <td> Invitrogen </td><td> A11011 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 get anti mus IgG1 </td><td> Invitrogen </td><td> A21121 </td></tr><tr><td> Monteringsmedium för fluorescens </td><td> Vector </td><td> H-1200 </td></tr><tr><td> ImmEdge penna </td><td> Vector </td><td> H-4000 </td></tr><tr><td> Poly-L-lysin belagd diabilder </td><td> Elektronmikroskopi vetenskaper </td><td> 63.410-01 </td></tr><tr><td> Mikroskop skyddsglas </td><td> Fisher </td><td> 12-543-D </td></tr><tr><td> Concaved objektglas </td><td> Fisher </td><td> 7-1305-8 </td></tr><tr><td> Dissection mikroskop </td><td> Leica MZ95 </td><td></td></tr><tr><td> Sammansatta mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axioplan2 </td></tr><tr><td> ApoTome </td><td> Zeiss </td><td></td></tr></tbody></table> PBST: 1 x PBS 0,5% Triton-X 100 ENT &quot;&gt; 25X Tricaine: 400 mg Tricaine 97,9 ml DDH 2 O 2,1 mL (1M Tris PH9) Justera pH till 7,0

immunostaining of dissected zebrafish embryonic heart

Zebrafisk embryo blir ett populärt in vivo ryggradsdjur modell för att studera hjärtats utveckling och mänskliga hjärtsjukdomar på grund av sitt fördelaktiga embryologi och genetik 1,2. Om 100-200 embryon finns tillgängliga varje vecka från ett enda par av vuxen fisk. Den transparenta embryon som utvecklar ex utero gör dem idealiska för att bedöma hjärtfel 3. Uttrycket av en gen kan manipuleras via morpholino teknik eller RNA injektion 4. Dessutom framåt genetiska skärmar har redan genererat en lista med mutanter som påverkar olika perspektiv på cardiogenesis 5. Hela montera immunfärgning är en viktig teknik i denna djurmodell för att avslöja uttrycket mönstret av de riktade protein för att en viss vävnad 6. Dock har högupplösta bilder som kan avslöja cellulär eller subcellulära strukturer varit svårt, främst på grund av den fysiska lokaliion av hjärtat och de fattiga penetrationen av antikroppar. Här presenterar vi en metod för att hantera dessa flaskhalsar genom att dissekera hjärta först och sedan genomför färgning processen på ytan av ett objektglas. För att förhindra förlust av små hjärtan prover och för att underlätta lösning hantering, vi begränsat hjärtat prov inom en cirkel på ytan av objektglas teckningar av en immEdge penna. Efter färgning kan fluorescens signaler observeras direkt av ett sammansatt mikroskop. Vår nya metod förbättrar avsevärt penetration för antikroppar, eftersom ett hjärta från en embryonal fisk bara består av ett fåtal cellager. Bilder med hög kvalitet från intakta hjärtan kan erhållas inom en mycket reducerad procession tid för zebrafisk gamla embryon från dag 2 till dag 6. Vår metod kan eventuellt utvidgas till att färga andra organ dissekeras från antingen zebrafisk eller andra smådjur.

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart at JoVE.com

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Ett snabbt sätt att göra immunfärgning av zebrafisk embryonala hjärta beskrivs. Jämfört med hela montera immunfärgning strategi, ökar denna metod dramatiskt penetrering av antikroppar, som gör det möjligt att få bilder med hög upplösning som visar cellulära / subcellulära strukturer i hjärtat inom en mycket reducerad handläggningstiden.

Immunfärgning av dissekerade Zebrafish Embryonala hjärta

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Live avbildning av Zebrafish embryonal hjärna av konfokalmikroskopi

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Tissue Riktade Embryonala chimärer: Zebrafish gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

Beredning av embryon för elektronmikroskopi av Drosophila Embryonala hjärta tub

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Microdissection av Zebrafish Embryonala Eye vävnader

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Hela montering Immunhistokemisk Analys för Embryonala Limb Skin kärlsystemet: ett modellsystem för studier Vascular Avgrening morfogenes i Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Hjärta Dissection i Larvernas, unga och vuxna Zebrafish, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Ett system för<em&gt; Ex vivo</em&gt; Odling av embryonala Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-vållad skada av Zebrafish embryonala skelettmuskulatur

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analys av embryonala och Larvernas Zebrafish Skelett myofibers från Dissocierade Förberedelser

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Metod för embryonala Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...