Name: visualization of vascular ca2+ signaling triggered by paracrine derived ros
Uploaded: 2011-12-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) till MM. Vår artikel är delvis stöds av Carl Zeiss mikrovisualisering LLC.

Reaktiva syreradikaler kan mätas i levande celler med oxidation känsliga färgämnen (1 &amp; 2) eller med hjälp av plasmid sensorer (3 &amp; 4) genom konfokalmikroskopi. 1. Visualisering av cytosolic ROS i J774 celler <ol><li> Väx J774.1 mus monocyte-derived makrofager (10 6 celler / ml) på glas botten 35 mm-rätter (Harvard apparater) för 48 h. </li><li> Utmana celler med TLR-agonister (2 mikrogram / ml, Lipo-teichoic syra-TLR2 agonist, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3 agonist...

<ol>
	<li>Madesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+role+for+superoxide+in+InsP3+receptor-mediated+mitochondrial+dysfunction+and+endothelial+apoptosis.">Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis.</a> J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).</li><li>Droge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+in+the+physiological+control+of+cell+function.">Free radicals in the physiological control of cell function.</a> Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).</li><li>Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+regulate+cellular+signaling+and+dictate+biological+outcomes.">Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes.</a> Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 .</li><li>Hawkins, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-glutathionylation+activates+STIM1+and+alters+mitochondrial+homeostasis.">S-glutathionylation activates STIM1 and alters mitochondrial homeostasis.</a> J. Cell. Biol. 190, 391-405 (2010).</li><li>Madesh, M., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VDAC-dependent+permeabilization+of+the+outer+mitochondrial+membrane+by+superoxide+induces+rapid+and+massive+cytochrome+c+release.">VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release.</a> J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).</li><li>Finkel, T., Holbrook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidants+oxidative+stress+and+the+biology+of+ageing.">Oxidants oxidative stress and the biology of ageing.</a> Nature. 408, 239-247 (2000).</li><li>Rittirsch, D., Flierl, M. A., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmful+molecular+mechanisms+in+sepsis.">Harmful molecular mechanisms in sepsis.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 776-787 (2008).</li><li>Sanlioglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+induces+Rac1-dependent+reactive+oxygen+species+formation+and+coordinates+tumor+necrosis+factor-alpha+secretion+through+IKK+regulation+of+NF-kappa.">Lipopolysaccharide induces Rac1-dependent reactive oxygen species formation and coordinates tumor necrosis factor-alpha secretion through IKK regulation of NF-kappa.</a> 276, 30188-30198 (2001).</li><li>Hawkins, B. J., Madesh, M., Kirkpatrick, C. J., Fisher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+flux+in+endothelial+cells+via+the+chloride+channel-3+mediates+intracellular+signaling.">Superoxide flux in endothelial cells via the chloride channel-3 mediates intracellular signaling.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 2002-2012 (2007).</li><li>Vliet, A. v. a. n. d. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+in+lung+biology+and+pathology:+host+defense+enzymes+and+more.">NADPH oxidases in lung biology and pathology: host defense enzymes and more.</a> Free Radic. Biol. Med. 44, 938-955 (2008).</li><li>Babior, B. M., Kipnes, R. S., Curnutte, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+defense+mechanisms.+The+production+by+leukocytes+of+superoxide,+a+potential+bactericidal+agent.">Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent.</a> J. Clin. Invest. 52, 741-744 (1973).</li><li>Lambeth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX+enzymes+and+the+biology+of+reactive+oxygen.">NOX enzymes and the biology of reactive oxygen.</a> Nat. Rev. Immunol. 4, 181-189 (2004).</li><li>Mukhopadhyay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy.">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nat. Protoc. 2, 2295-2301 (2007).</li><li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish.">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459, 996-999 (2009).</li><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+and+innate+immunity.">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).</li></ol>

Den metod som beskrivs här tillåter snabb och kvantitativ mätning av reaktiva syreradikaler i levande celler, antingen med hjälp av oxidation känsliga färgämnen eller plasmid sensorer. Agonister av TLRs (Toll-liknande receptorer) är föreningar som stimulerar cellerna via TLRs som finns på cellytan och utlösa nedströms signalvägar 15. I vårt protokoll, använde vi tre olika TLR-agonister nämligen, Lipo-teichoic syra-TLR2 agonist, Poly (I: C).-TLR3 agonist, LPS-TLR4 agonist som rapporteras att in...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Attofluor cell kammare </td><td> Invitrogen </td><td> A7816 </td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8674 </td></tr><tr><td> DMEM låga glukos medelstora </td><td> Invitrogen </td><td> 10567-014 </td></tr><tr><td> Endothelial growth factor tillägg (EKG) </td><td> Upstate </td><td> 02-102 </td></tr><tr><td> Fetalt bovinserum </td><td> Invitrogen </td><td> 12662011 </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Invitrogen </td><td> 10131-027 </td></tr><tr><td> Gelatin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1393 </td></tr><tr><td> H 2 DCFDA </td><td> Invitrogen </td><td> D-399 </td></tr><tr><td> LPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L4516 </td></tr><tr><td> LTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L2515 </td></tr><tr><td> MitoSOX Red </td><td> Invitrogen </td><td> M36008 </td></tr><tr><td> Opti-MEM jag Minskad Serum Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 51985091 </td></tr><tr><td> Penna / Strep (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140163 </td></tr><tr><td> pHyPer-cyto </td><td> Evrogen </td><td> FP941 </td></tr><tr><td> pHyPer-dMito </td><td> Evrogen </td><td> FP942 </td></tr><tr><td> Poly (I: C) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0913 </td></tr><tr><td> Prism programvara 5,0 </td><td> GraphPad Software, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> SigmaPlot 11,0 </td><td> Systat Software, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400054 </td></tr><tr><td> T-25 Kolvar </td><td> Corning </td><td> 430.639 </td></tr><tr><td> T-75 Kolvar </td><td> BD Falcon </td><td> 353.136 </td></tr><tr><td> 96-väl TC mikro brunnar </td><td> BD Falcon </td><td> 353.072 </td></tr><tr><td> Zen 2009 programvara </td><td> Carl Zeiss 510 Meta konfokalmikroskopi </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of vascular ca2+ signaling triggered by paracrine derived ros

Oxidativ stress har varit inblandad i ett antal patologisk tillstånd inklusive ischemi / reperfusion skador och sepsis. Begreppet oxidativ stress hänvisar till avvikande bildningen av ROS (reaktivt syre arter), som inkluderar O 2 • -, H 2 O 2, och hydroxylradikaler. Reaktiva syreradikaler påverkar en mängd olika cellulära processer, inklusive signaltransduktion, celltillväxt och celldöd 1-6. ROS har potential att skada kärl och celler orgel direkt, och kan initiera sekundära kemiska reaktioner och genetiska förändringar som i slutändan leder till en förstärkning av den initiala ROS-medierad vävnadsskada. En viktig del av förstärkningen kaskad som förvärrar irreversibla vävnadsskador är rekrytering och aktivering av cirkulerande inflammatoriska celler. Under inflammation, inflammatoriska celler producerar cytokiner såsom tumörnekrosfaktor-α (TNF) och IL-1 somaktivera endotelceller (EG) och epitelceller och ytterligare förstärka det inflammatoriska svaret 7. Vascular endothelial dysfunktion är ett etablerat inslag av akut inflammation. Makrofager bidra till endoteldysfunktion vid inflammation av mekanismer som fortfarande oklara. Aktivering av makrofager resulterar i det extracellulära utsläpp av O 2 • - och olika pro-inflammatoriska cytokiner, som triggar patologiska signalering i angränsande celler 8. NADPH oxidases är de stora och primära källan för ROS i de flesta celltyper. Nyligen visas det av oss och andra 9,10 som ROS produceras av NADPH oxidases förmå mitokondriella ROS-produktion under många patofysiologiska förhållanden. Därför mätning av mitokondriella ROS-produktionen är lika viktigt Förutom att mäta cytosoliska ROS. Makrofager producerar ROS av flavoprotein enzymet NADPH-oxidas som spelar en central roll i inflammation. När den är aktiveradfagocytiska NADPH-oxidas producerar stora mängder av O 2 • - som är viktiga i den mottagande försvarsmekanism 11,12. Även parakrina-derived O 2 • - spelar en viktig roll i patogenesen av vaskulära sjukdomar, visualisering av parakrina ROS-inducerad intracellulär signalering inklusive Ca 2 + mobilisering är fortfarande hypotes. Vi har utvecklat en modell där aktiverade makrofager används som en källa till O 2 • - att transduce en signal till angränsande endotelceller. Med hjälp av denna modell visar vi att makrofager som härrör O 2 • - leda till kalcium signalering i angränsande endotelceller.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS at JoVE.com

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

En effektiv metod för att få insikt i att visualisera parakrina-derived ROS induktion av endotel Ca2 +-signalering beskrivs. Denna metod tar fördel av att mäta parakrina härrör ROS utlöste Ca2 + mobilisering i vaskulära endotelceller i en co-kultur-modellen.

Visualisering av Vascular Ca 2 + Signalering Triggade av parakrina Härledda ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Tekniker för Imaging Ca 2 + Signalering i mänskliga spermier

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Visualisering av ATP-syntas dimerer i Mitokondrier från Electron Cryo-tomografi

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Automatiserad analys av dynamiska Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaler i bildsekvenser

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fekal Glukokortikoid Analys: Icke-invasiv Adrenal Övervakning av equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

DiI Perfusion som en metod för vaskulär visualisering i<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisering av DNA packning i cyanobakterier av högspännings-Cryo-elektron tomografi

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal Cryo-sektioner, hela-fästen och hypoton isolerade vaskulatur förberedelserna inför immunhistokemisk visualisering av mikrovaskulära pericyter

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

En Proximal kultur metod att studera parakrin signalering mellan celler

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

Myeloisk medfödda signalering utbildningsavsnitt förordning av MALT1 Paracaspase aktivitet

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Tillämpningar av plats och tid kartläggning och partikel analystekniker för att kvantifiera intracellulära Ca2 + signalering In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...