Name: determination of lipid raft partitioning of fluorescently-tagged probes in living cells by fluorescence correlation spectroscopy (fcs)
Uploaded: 2012-04-06T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par une subvention de l&#39;Agence Nationale de la Recherche (ChoAD). Nous sommes également reconnaissants à la Fondation de l&#39;ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle) pour leur soutien financier.

1. Calibrage de l&#39;installation de FCS <ol><li> Démarrez le microscope confocal, les lasers, les ordinateurs, un incubateur pour la température et le CO 2 de contrôle. </li><li> Assurez-vous que le SPAD (Single Photon Avalanche Diode) est allumé et le filtre de fluorescence à l&#39;intérieur du SPAD est bien adapté à votre échantillon. Vérifiez que le SPAD est synchronisé dans le temps. Attention à ne lancer votre logiciel FCS fois vos paramètres SPAD sont prêts pour l&#39;acquisition. </li...

<ol>
	<li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+lipid+rafts+in+biological+membranes.">Functions of lipid rafts in biological membranes.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).</li><li>Simons, K., Gerl, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revitalizing+membrane+rafts:+new+tools+and+insights.">Revitalizing membrane rafts: new tools and insights.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).</li><li>Simons, K., Ehehalt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol,+lipid+rafts,+and+disease.">Cholesterol, lipid rafts, and disease.</a> J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).</li><li>Munro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts:+elusive+or+illusive.">Lipid rafts: elusive or illusive.</a> Cell. , 115-377 (2003).</li><li>Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts:+now+you+see+them,+now+you+don't.">Lipid rafts: now you see them, now you don't.</a> Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).</li><li>Pralle, A., Keller, P., Florin, E. L., Simons, K., Horber, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid-cholesterol+rafts+diffuse+as+small+entities+in+the+plasma+membrane+of+mammalian+cells.">Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells.</a> J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).</li><li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+sphingolipid-+and+cholesterol-rich+membrane+rafts.">Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts.</a> J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).</li><li>Sharma, P., Sabharanjak, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+lipid+rafts:+an+identity+crisis.">Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).</li><li>Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+lipid+mobility+of+raft-exhibiting+model+membranes+by+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).</li><li>Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+relates+rafts+in+model+and+native+membranes.">Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes.</a> Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).</li><li>Kim, S. A., Heinze, K. G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+in+living+cells.">Fluorescence correlation spectroscopy in living cells.</a> Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).</li><li>Marquer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+cholesterol+increase+triggers+amyloid+precursor+protein-Bace1+clustering+in+lipid+rafts+and+rapid+endocytosis.">Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis.</a> FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).</li><li>Tian, Y., Martinez, M. 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P., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+surface+dynamics+of+biomolecules+by+total+internal+reflection+fluorescence+with+photobleaching+recovery+or+correlation+spectroscopy.">Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy.</a> Biophys. J. 33, 435-454 (1981).</li><li>Thompson, N. L., Steele, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+with+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).</li><li>Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+the+nanoscale+dynamics+of+membrane+lipids+in+a+living+cell.">Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell.</a> Nature. 457, 1159-1162 (2009).</li><li>Kolin, D. L., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+image+correlation+spectroscopy:+measuring+number+densities,+aggregation+states,+and+dynamics+of+fluorescently+labeled+macromolecules+in+cells.">Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells.</a> Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).</li><li>Shvartsman, D. E., Kotler, M., Tall, R. D., Roth, M. G., Henis, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differently+anchored+influenza+hemagglutinin+mutants+display+distinct+interaction+dynamics+with+mutual+rafts.">Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts.</a> J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).</li><li>White, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holin+triggering+in+real+time.">Holin triggering in real time.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).</li><li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy:+concept+and+application.">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).</li><li>Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+image+correlation+spectroscopy+(STICS)+theory,+verification,+and+application+to+protein+velocity+mapping+in+living+CHO+cells.">Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells.</a> Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).</li><li>Digman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fast+dynamics+in+solutions+and+cells+with+a+laser+scanning+microscope.">Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope.</a> Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).</li><li>Digman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuation+correlation+spectroscopy+with+a+laser-scanning+microscope:+exploiting+the+hidden+time+structure.">Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure.</a> Biophys. J. 88, L33-L36 (2005).</li><li>Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F. G., Petersen, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+GPI-anchored+proteins+on+the+surface+of+living+cells.">Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells.</a> Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).</li><li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+image+correlation+spectroscopy+(PICS):+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data.">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys. J. 92, 613-621 (2007).</li><li>Bates, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lateral+diffusion+and+capture+of+CFTR+within+transient+confinement+zones.">Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones.</a> Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).</li></ol>

La méthode présentée ici permet de FCS une analyse sensible et rapide de la répartition des lipides radeau de sondes fluorescentes d&#39;intérêt dans les cellules vivantes. FCS combine la précision de la localisation de la microscopie confocale avec la sensibilité de comptage de photon unique. La principale différence entre FCS et standards techniques biochimiques, c&#39;est que FCS permet la détermination absolue de lipides radeaux de la partition de la cible et non pas la partition relative comme c&#39;est l...

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Sous-unité toxine B du choléra-Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> C-34775 </td><td> MW (pentamère) = 57 kg / mol </td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Incubateur pour la température et le CO 2 de contrôle </td><td> La vie des services d&#39;imagerie </td><td> Le Cube et la boîte de </td><td></td></tr><tr><td> SPAD (Single Photon Avalanche Diode) </td><td> MPD (Micro Devices Photon) </td><td> PDM série (100 um zone sensible) </td><td></td></tr><tr><td> Passe-haut 488 nm filtre </td><td> Semrock </td><td> 488 nm de blocage de bord Brightline filtre passe-long N ° de pièceails.aspx? id = FF01-488/LP-25 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; FF01-488/LP-25 </td><td></td></tr><tr><td> Unité de détection de FCS </td><td> Picoquant </td><td> Picoharp 300 modules </td><td></td></tr><tr><td> Acquisition et d&#39;auto-corrélation de logiciels </td><td> Picoquant </td><td> SymPhoTime </td><td></td></tr><tr><td> Logiciel de montage </td><td> OriginLab </td><td> OriginPro8 </td><td></td></tr></tbody></table>

determination of lipid raft partitioning of fluorescently-tagged probes in living cells by fluorescence correlation spectroscopy (fcs)

Au cours des quinze dernières années la notion que les membranes cellulaires ne sont pas homogènes, et s&#39;appuyer sur des microdomaines à exercer leurs fonctions est désormais largement admis. Les radeaux lipidiques sont des microdomaines membranaires enrichis en cholestérol et en sphingolipides. Ils jouent un rôle dans les processus physiologiques cellulaires tels que la signalisation, et de 1,2 le trafic, mais sont également pensés pour être des acteurs clés dans plusieurs maladies dont les infections virales ou bactériennes et les maladies neurodégénératives 3. Pourtant, leur existence est encore un sujet de controverse 4,5. En effet, la taille radeau lipidique a été estimé à environ 20 nm 6, loin sous la limite de résolution du microscope conventionnel (environ 200 nm), les empêchant ainsi de l&#39;imagerie directe. Jusqu&#39;à présent, les principales techniques utilisées pour évaluer la partition de protéines d&#39;intérêt à l&#39;intérieur de radeaux lipidiques étaient membranes résistant aux détergents (DRM) d&#39;isolement et de co-patching avec des anticorps. Bien que largement utilisé becal&#39;utilisation de leur mise en œuvre assez facile, ces techniques étaient enclins à des artefacts et donc critiqué 7,8. Les améliorations techniques sont donc nécessaires pour surmonter ces objets et d&#39;être en mesure de sonder lipidique des radeaux de partition dans les cellules vivantes. Nous présentons ici une méthode pour l&#39;analyse sensible de lipides radeaux partition de protéines par fluorescence-étiquetés ou des lipides dans la membrane plasmique des cellules vivantes. Cette méthode, appelée spectroscopie par corrélation de fluorescence (FCS), repose sur la disparité des temps de diffusion de sondes fluorescentes situées à l&#39;intérieur ou à l&#39;extérieur des radeaux lipidiques. En fait, comme en témoignent les deux membranes artificielles et des cultures cellulaires, les sondes serait de diffuser beaucoup plus rapidement en dehors qu&#39;à l&#39;intérieur des radeaux lipidiques denses 9,10. Pour déterminer des temps de diffusion, minute fluctuations de fluorescence sont mesurées en fonction du temps dans un volume focal (environ 1 femtolitre), situé à la membrane plasmique de cellules avec un microscope confocal (fig.1). Les courbes d&#39;auto-corrélation peut alors être tirée de ces fluctuations et équipé des modèles appropriés de diffusion mathématiques 11. FCS peut être utilisé pour déterminer le radeau lipidique de cloisonnement de sondes différentes, tant qu&#39;ils sont marquées par fluorescence. Fluorescente marquage peut être obtenue par expression de protéines de fusion fluorescentes ou par liaison de ligands fluorescents. Par ailleurs, FCS peut être utilisé non seulement dans des membranes artificielles et des lignées cellulaires, mais aussi dans des cultures primaires, tel que décrit récemment 12. Il peut également être utilisé pour suivre la dynamique de la séparation des lipides radeau après l&#39;addition de drogues ou de changements dans la composition des lipides membranaires 12.

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Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Une technique pour sonder le cloisonnement radeau lipidique des protéines fluorescentes à la membrane plasmique de cellules vivantes est décrite. Il tire profit de la disparité des temps de diffusion des protéines situées à l&#39;intérieur ou à l&#39;extérieur des radeaux lipidiques. L&#39;acquisition peut être effectuée de manière dynamique dans des conditions de contrôle ou après l&#39;addition de drogues.

Détermination de radeaux lipidiques partitionnement de sondes par fluorescence-marqués dans les cellules vivantes par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

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