Name: determination of lipid raft partitioning of fluorescently-tagged probes in living cells by fluorescence correlation spectroscopy (fcs)
Uploaded: 2012-04-06T13:00:00
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Este trabalho foi financiado por uma subvenção da Agence Nationale de la Recherche (ChoAD). Também somos gratos ao ICM Fondation (Institut du Cerveau et de la Moelle) pelo apoio financeiro.

1. Calibração do Setup FCS <ol><li> Inicie o microscópio confocal, lasers, computadores, incubadora para controle de temperatura e CO 2. </li><li> Certifique-se que a SPAD (Diodo Avalanche de fóton único) é ligado e que o filtro de fluorescência dentro do SPAD está bem adaptado à sua amostra. Verificar que a SPAD está sincronizado com o tempo. Cuidado apenas para iniciar o seu software FCS uma vez que suas configurações SPAD estão prontos para a aquisição. </li><li> Prepara-se uma solução f...

<ol>
	<li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+lipid+rafts+in+biological+membranes.">Functions of lipid rafts in biological membranes.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).</li><li>Simons, K., Gerl, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revitalizing+membrane+rafts:+new+tools+and+insights.">Revitalizing membrane rafts: new tools and insights.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).</li><li>Simons, K., Ehehalt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol,+lipid+rafts,+and+disease.">Cholesterol, lipid rafts, and disease.</a> J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).</li><li>Munro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts:+elusive+or+illusive.">Lipid rafts: elusive or illusive.</a> Cell. , 115-377 (2003).</li><li>Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts:+now+you+see+them,+now+you+don't.">Lipid rafts: now you see them, now you don't.</a> Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).</li><li>Pralle, A., Keller, P., Florin, E. L., Simons, K., Horber, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid-cholesterol+rafts+diffuse+as+small+entities+in+the+plasma+membrane+of+mammalian+cells.">Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells.</a> J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).</li><li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+sphingolipid-+and+cholesterol-rich+membrane+rafts.">Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts.</a> J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).</li><li>Sharma, P., Sabharanjak, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+lipid+rafts:+an+identity+crisis.">Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).</li><li>Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+lipid+mobility+of+raft-exhibiting+model+membranes+by+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).</li><li>Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+relates+rafts+in+model+and+native+membranes.">Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes.</a> Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).</li><li>Kim, S. A., Heinze, K. G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+in+living+cells.">Fluorescence correlation spectroscopy in living cells.</a> Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).</li><li>Marquer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+cholesterol+increase+triggers+amyloid+precursor+protein-Bace1+clustering+in+lipid+rafts+and+rapid+endocytosis.">Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis.</a> FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).</li><li>Tian, Y., Martinez, M. 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P., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+surface+dynamics+of+biomolecules+by+total+internal+reflection+fluorescence+with+photobleaching+recovery+or+correlation+spectroscopy.">Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy.</a> Biophys. J. 33, 435-454 (1981).</li><li>Thompson, N. L., Steele, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+with+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).</li><li>Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+the+nanoscale+dynamics+of+membrane+lipids+in+a+living+cell.">Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell.</a> Nature. 457, 1159-1162 (2009).</li><li>Kolin, D. L., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+image+correlation+spectroscopy:+measuring+number+densities,+aggregation+states,+and+dynamics+of+fluorescently+labeled+macromolecules+in+cells.">Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells.</a> Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).</li><li>Shvartsman, D. E., Kotler, M., Tall, R. D., Roth, M. G., Henis, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differently+anchored+influenza+hemagglutinin+mutants+display+distinct+interaction+dynamics+with+mutual+rafts.">Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts.</a> J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).</li><li>White, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holin+triggering+in+real+time.">Holin triggering in real time.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).</li><li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy:+concept+and+application.">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).</li><li>Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+image+correlation+spectroscopy+(STICS)+theory,+verification,+and+application+to+protein+velocity+mapping+in+living+CHO+cells.">Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells.</a> Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).</li><li>Digman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fast+dynamics+in+solutions+and+cells+with+a+laser+scanning+microscope.">Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope.</a> Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).</li><li>Digman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuation+correlation+spectroscopy+with+a+laser-scanning+microscope:+exploiting+the+hidden+time+structure.">Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure.</a> Biophys. J. 88, L33-L36 (2005).</li><li>Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F. G., Petersen, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+GPI-anchored+proteins+on+the+surface+of+living+cells.">Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells.</a> Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).</li><li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+image+correlation+spectroscopy+(PICS):+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data.">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys. J. 92, 613-621 (2007).</li><li>Bates, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lateral+diffusion+and+capture+of+CFTR+within+transient+confinement+zones.">Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones.</a> Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).</li></ol>

O método aqui apresentado FCS permite uma análise sensível e rápido da compartimentação jangada lipídico de sondas fluorescentes de interesse em células vivas. FCS combina a precisão da localização de microscopia confocal com a sensibilidade de contagem de fotão único. A principal diferença entre FCS e técnicas padrão de bioquímicos é que permite a determinação de FCS absoluta da partição jangadas lipídica do alvo e não a partição relativa como é o caso para GDD isolamento ou de co-patching. <...

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Cólera subunidade toxina B-488 Alexa </td><td> Invitrogen </td><td> C-34.775 </td><td> MW (pentâmero) = 57 kg mol / </td></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Incubadora de temperatura e CO controle 2 </td><td> Vida serviços de imagem </td><td> O Cubo ea Caixa </td><td></td></tr><tr><td> SPAD (Diodo Avalanche de fóton único) </td><td> MPD (Micro Devices Photon) </td><td> PDM serie (100 mM área sensível) </td><td></td></tr><tr><td> Passa-alto 488 nm filtro </td><td> Semrock </td><td> 488 nm de bloqueio borda BrightLine longo filtro passa Part #ails.aspx? id = FF01-488/LP-25 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; FF01-488/LP-25 </td><td></td></tr><tr><td> FCS unidade de detecção </td><td> Picoquant </td><td> Picoharp módulo 300 </td><td></td></tr><tr><td> Aquisição e auto-correlação software </td><td> Picoquant </td><td> SymPhoTime </td><td></td></tr><tr><td> Software de adaptação </td><td> OriginLab </td><td> OriginPro8 </td><td></td></tr></tbody></table>

determination of lipid raft partitioning of fluorescently-tagged probes in living cells by fluorescence correlation spectroscopy (fcs)

Nos últimos quinze anos, a noção de que as membranas celulares não são homogêneas e dependem de microdomínios de exercer suas funções tornou-se amplamente aceita. Jangadas lipídicas são microdomínios de membrana enriquecidos em colesterol e esfingolipídios. Eles desempenham um papel em processos fisiológicos celulares, tais como sinalização, e 1,2 tráfico, mas também estão pensados ​​para ser os principais intervenientes em várias doenças, incluindo infecções virais ou bacterianas e doenças neurodegenerativas 3. No entanto, sua existência é ainda uma questão controversa 4,5. Na verdade, o tamanho rafts lipídicos foi estimado em cerca de 20 nm 6, muito abaixo do limite de resolução do microscópio convencional (cerca de 200 nm), impossibilitando a sua imagem direta. Até agora, as principais técnicas utilizadas para avaliar a partição de proteínas de interesse dentro de balsas lipídicas foram Membranas resistentes detergentes (DRMs) de isolamento, e co-patch com os anticorpos. Beca Embora amplamente utilizadauso de sua execução bastante fácil, estas técnicas eram propensos a artefatos e, portanto, criticou 7,8. Melhoramentos técnicos foram, portanto, necessário para ultrapassar estes artefactos e para ser capaz de detectar partição jangadas lipídica em células vivas. Apresentamos aqui um método para a análise sensível de partição lípido jangadas de proteínas fluorescentes-etiquetados ou lípidos na membrana plasmática de células vivas. Este método, denominado Espectroscopia de Correlação de fluorescência (FCS), baseia-se na disparidade em tempos de difusão de sondas fluorescentes localizados dentro ou fora de jangadas lipídicas. De fato, como evidenciado em ambas as membranas artificiais e culturas de células, as sondas seria difundir muito mais rapidamente do lado de fora balsas lipídicas densos 9,10. Para determinar tempos de difusão, hora flutuações de fluorescência são medidos como uma função do tempo em um volume focal (aproximadamente 1 femtoliter), localizada na membrana plasmática de células com um microscópio confocal (Fig.1). As curvas de auto-correlação pode, então, ser extraída estas flutuações e equipado com modelos de difusão adequadas matemáticas 11. FCS pode ser usado para determinar a jangada lípido particionamento de sondas diferentes, contanto que eles são fluorescentemente marcado. Fluorescente marcação pode ser conseguida através da expressão de proteínas de fusão fluorescentes ou por ligação de ligandos fluorescentes. Além disso, FCS pode ser usado não apenas em membranas artificiais e linhas de células, mas também em culturas primárias, como descrito recentemente 12. Também pode ser utilizado para seguir a dinâmica da compartimentação jangada lípido após a adição da droga ou a mudança de membrana composição lipídica 12.

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Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Uma técnica para sondar o particionamento jangada lipídico de proteínas fluorescentes na membrana plasmática de células vivas é descrito. Leva vantagem da disparidade em tempos de difusão de proteínas localizadas dentro ou fora de jangadas lipídicas. A aquisição pode ser realizada de forma dinâmica em condições de controlo ou após a adição da droga.

Determinação da Raft Lipid Particionamento de Sondas marcadas com fluorescência em células vivas por Espectroscopia de Correlação de Fluorescência (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

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