Name: efficient recombinant parvovirus production with the help of adenovirus-derived systems
Uploaded: 2012-04-23T12:00:00
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Wir danken dem Team des DKFZ Virus Produktion und Entwicklung ausgeben, insbesondere Marcus Müller, Silvia Münstermann, Barbara Liebetrau, und Mandy Roscher. Diese Studie wurde teilweise durch Zuschüsse aus dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) und der Helmholtz-Gemeinschaft im Rahmen des Deutschen Krebsforschungszentrums / Cancéropôle du Grand-Est gemeinsamen Programm in Applied Tumorvirologie unterstützt.

Beachten Sie, dass ein Labor mit Sicherheitsstufe 2 für die Produktion rekombinanter Parvoviren (recPV) ist erforderlich. Das Protokoll ist in zwei Hauptteile gegliedert. Der erste Teil (Herstellung von recPV durch Transfektion) benötigt, um die minimale Menge an recPVs, die als Inokulum dient im zweiten Teil des Protokolls (Herstellung von recPVs durch Infektion) zu erzeugen. Sobald eine kleine Menge von recPVs erzeugt wird, der erste Teil des Protokolls weggelassen werden kann, und die r...

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	<li>Cotmore, S. F., Tattersall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvoviral+host+range+and+cell+entry+mechanisms.">Parvoviral host range and cell entry mechanisms.</a> Adv. Virus. Res. 70, 183 (2007).</li><li>Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+parvoviruses+as+cancer+therapeutics.">Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185 (2010).</li><li>Hristov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+Its+Nonstructural+Protein+NS1,+Parvovirus+H-1+Induces+Apoptosis+via+Accumulation+of+Reactive+Oxygen+Species.">Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species.</a> J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).</li><li>Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+based+on+autonomous+parvoviruses:+novel+tools+to+treat+cancer.">Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer.</a> J. Virol. 6, 193-193 (2004).</li><li>El-Andaloussi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+adenovirus-based+helper+system+to+support+production+of+recombinant+parvovirus.">Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus.</a> Cancer Gene Ther. 18, (2011).</li><li>Kestler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis+requirements+for+the+efficient+production+of+recombinant+DNA+vectors+based+on+autonomous+parvoviruses.">cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses.</a> Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).</li><li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus.">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> J. Virol. 72, 2224 (1998).</li><li>He, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses.">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509 (1998).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene. Ther. 6, 973 (1999).</li><li>Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+production+of+recombinant+AAV+by+transient+transfection+of+NB324K+cells+using+electroporation.">Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation.</a> J. Virol. Methods. 63, 129 (1997).</li><li>Wrzesinski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+and+pseudotyped+parvoviruses+minimize+the+contamination+of+recombinant+stocks+with+replication-competent+viruses+and+identify+a+DNA+sequence+that+restricts+parvovirus+H-1+in+mouse+cells.">Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells.</a> J. Virol. 77, 3851 (2003).</li></ol>

Wir haben gezeigt, dass recPV Produktion durch die Anwesenheit von adenoviralen Genom-Elemente erhöht werden kann. Wir haben die recPV Ausbeuten von mehr als 10-fach (0,3 bis 5 TU / Zelle) erhöht, indem Adenovirus genomische Element über Transfektion und durch mehr als 100-fach Co-Infizieren der Zellen mit Ad-VP-Helfer in Kombination mit dem in recPV Vergleich zu herkömmlichen Protokollen. Die hier beschriebene Protokoll kann durch die Bestimmung der am besten geeigneten Zeitpunkt für die Lieferung der Adenovirus-G...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Sigma </td><td> M4655 </td></tr><tr><td> Fötale Rinderserum </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Gibco </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> Fugene </td><td> Roche </td><td> 047097050001 </td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300062 </td></tr><tr><td> Benzonase Nuclease </td><td> Sigma </td><td> E8263 </td></tr><tr><td> Adeno-X Schnelle Titer Kit </td><td> Clontech </td><td> 632250 </td></tr></tbody></table>

efficient recombinant parvovirus production with the help of adenovirus-derived systems

Nagetier-Parvoviren (PV) wie Ratten H-1PV und MVM, sind kleine ikosaedrische, einzelsträngige, DNA-Viren. Das Genom enthält zwei Promotoren P4 und P38, die die Expression von nicht-strukturellen (NS1 und NS2) und Kapsid-Proteine ​​(VP1 und VP2), die jeweils 1 zu regulieren. Sie ziehen hohe Zinsen als Antikrebsmittel für ihre onkolytischen und oncosuppressive Fähigkeiten, aber dabei nicht-pathogen für den Menschen 2. NS1 ist das zentrale viraler Cytotoxizität 3. Zur weiteren Verbesserung ihrer natürlichen antineoplastischen Aktivitäten wurden Derivate von diesen Vektoren durch Ersetzen des Gens, das für die Kapsidproteine ​​mit einem therapeutischen Transgens (zB ein zytotoxisches Polypeptid, Cytokin, Chemokin, Tumorsuppressor-Gen usw.) 4 erzeugt wurde. Die rekombinanten Parvoviren (recPVs) Vektor behält die NS1 / 2 kodierenden Sequenzen und die PV-Genom Telomere, die notwendig für die virale DNA-Amplifikation und Verpackung sind. Herstellung vonrecPVs nur, wenn die Produzentenzellen (in der Regel HEK293T), durch Co-Transfektion der Zellen mit einem zweiten Vektor (pCMV-VP) Exprimieren des Gens, das für die VP-Proteine ​​(Abb. 1) 4. Die recPV Vektoren auf diese Weise erzeugt werden, sind Replikation defekt. Obwohl recPVs erwies sich verbesserte oncotoxic Aktivitäten in Bezug auf die elterliche Viren, von denen sie erzeugt worden sein besitzen, bleibt ihre Produktion eine große Herausforderung und stark behindert die Verwendung dieser Mittel im Anti-Krebs-klinische Anwendungen. Wir fanden, dass die Einführung eines Ad-5-abgeleiteten Vektor, der das E2a, E4 (orf6) und die VA-RNA-Gene (zB pXX6 Plasmid) in HEK293T verbessert die Herstellung von recPVs um mehr als 10-fach im Vergleich zu anderen Protokolle verwendet. Basierend auf dieser Erkenntnis, haben wir eine neue Ad-VP-Helfer, dass die genomische adenoviralen Elemente notwendig, recPVs Produktion zu verbessern sowie die parvovir enthält gebautuns VP-Einheit 5-Gen. Die Verwendung von Ad-VP-Helfer-, ermöglicht die Herstellung von rec-PV unter Verwendung eines Protokolls, die vollständig von den viralen Infektion Schritte (im Gegensatz zu Plasmid-Transfektion gegenüberliegenden), die Ermöglichung der Verwendung von Zelllinien, die schwer zu transfizieren (zB NB324K) ( Abb.. 2). Wir stellen eine Methode verbessert das groß die Menge des produzierten rekombinanten Virus, wodurch sowohl die Produktionszeiten und-kosten, ohne dass die Qualität des Endproduktes 5. Darüber hinaus ist die großtechnische Herstellung von recPV (in Suspension Zellen und Bioreaktoren) nun denkbar.

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Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Hier beschreiben wir ein Protokoll nur auf Zellinfektion, was die Effizienz von rekombinanten Parvovirus-Produktion um mehr als 100-fach im Vergleich zu anderen Protokolle verwendet verbessert bezogen. Dieses Protokoll basiert auf der Verwendung einer neuartigen Adenovirus-5-basiertes Hilfsprogramm mit dem Parvovirus VP Transkriptionseinheit (Ad-VP).

Effiziente rekombinanten Parvovirus Produktion mit Hilfe von Adenovirus-abgeleiteten Systemen

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Die Schätzung Virus Produktionsraten in aquatischen Systemen

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Rekombinanten retroviralen Produktion und Infektion von B-Zellen

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Optimiertes Protokoll für die effiziente Transfektion von dendritischen Zellen ohne Zell-Reifung

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produktion und Titrierung von rekombinanten Adeno-assoziierte virale Vektoren

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Skalierbare High Throughput Auswahl aus Phagen-Antikörperbibliotheken angezeigt Synthetische

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Einfache und effiziente Herstellung und Reinigung von Maus-Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein für experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Erkennung und Entfernung von Nuklease Kontamination während der Reinigung von rekombinanten Prototyp schaumig Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Generierung von rekombinanten aviären Herpesvirus Vektoren mit CRISPR/Cas9 gen bearbeiten

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...