Name: intracellular refolding assay
Uploaded: 2012-01-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intracellular Refolding Assay at JoVE.com

دانيلو Maddalo هو حاصل على زمالة بحثية والفريق محقق يونغ (YIG) من معهد كارلسروه للتكنولوجيا.

1. بذر الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل أن يبدأ الاحماء المتوسطة والثقافة ، وبرنامج تلفزيوني والتربسين 1X في حمام من الماء عند 37 ˚ C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ الخلايا من الحاضنة ونضح في المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبق بلطف 5 م?...

<ol>
	<li>Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+and+protein+quality+control.">Molecular chaperones and protein quality control.</a> Cell. 125, 443-443 (2006).</li><li>Ritossa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+heat+shock+response.">Discovery of the heat shock response.</a> Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).</li><li>Hendrick, J. P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperone+functions+of+heat-shock+proteins.">Molecular chaperone functions of heat-shock proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).</li><li>Fuqua, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+proteins+and+drug+resistance.">Heat shock proteins and drug resistance.</a> Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).</li><li>Guzhova, I., Margulis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperone+as+a+survival+factor+in+cell+pathology.">Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology.</a> Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).</li><li>Whitesell, L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90+and+the+chaperoning+of+cancer.">HSP90 and the chaperoning of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG:+mechanisms+of+antitumour+activity.">17-AAG: mechanisms of antitumour activity.</a> Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).</li><li>Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HSP70+for+cancer+therapy.">Targeting HSP70 for cancer therapy.</a> Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).</li><li>Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+provides+neuroprotection+by+reducing+oxidative+stress+and+HSP70+expression+during+chronic+cerebral+hypoperfusion+in+ovariectomized+rats.">Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats.</a> J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).</li><li>Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaK,+DnaJ+and+GrpE+form+a+cellular+chaperone+machinery+capable+of+repairing+heat-induced+protein+damage.">DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage.</a> EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).</li><li>Thulasiraman, V., Matts, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+geldanamycin+on+the+kinetics+of+chaperone-mediated+renaturation+of+firefly+luciferase+in+rabbit+reticulocyte+lysate.">Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate.</a> Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).</li><li>Howarth, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp40+molecules+that+target+to+the+ubiquitin-proteasome+system+decrease+inclusion+formation+in+models+of+polyglutamine+disease.">Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease.</a> Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).</li><li>Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bag1+functions+in+vivo+as+a+negative+regulator+of+Hsp70+chaperone+activity.">Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).</li></ol>

في هذا العمل هو تقديم بروتوكولا لقياس نشاط الخلايا refolding من المحرمين الجزيئية. ويمكن إجراء فحص كامل في 3 إلى 4 أيام كما هو مبين من خلال نظرة عامة في الشكل. 1. متانة والخطي من الإشارات الضوئية التي تنتجها يراعة وluciferase renilla تم?...

عن هذه التجربة &quot;الخفيفة المتجهات&#39; إلى Luminometer شكل بيركن إلمر عداد التلألؤ &#39;1420كان يستخدم برامج لLuminometer : Renilla : مضخة 1 ، 100 حقن ميكرولتر رد فعل الاحتياطي : Pump1 ، 70 حقن ميكرولتر Luciferin : Pump2 ، حقن 30μl لمخازن إعداد هذه الحلول الأسهم في الماء المقطر مزدوجة : <ul style="list-style:none;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- 1M MgSO 4 : 246،48 ز MgSO 4 * 7H 2 O في 1 ليتر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- 0،5 م EGTA : 190،18 ز EGTA في 1 ليتر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- 1M KH 2 ص 4 : 136،09 ز KH 2 PO 4 في 1 ليتر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- 1M K2 هبو 4 : 228،23 ز ك 2 هبو 4 * 3H 2 O في 1 ليتر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- كلوريد الصوديوم 5M : 292،2 غرام كلوريد الصوديوم في 1 ليتر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- 0،5 م EDTA : 186،12 ز EDTA * 2H 2 O في 1 ليتر &nbsp;</li></ul> الغليسين - الغليسين العازلة : <ul style="list-style:none;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- 25mM Glycylglycin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- 15mM MgSO 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- 4mM EGTA </li></ul> 1 لتر للاستخدام 3،3 غرام من Glycylglycin ، 15ml حل MgSO4 1M و8ml حل EGTA 0،5 م. حل في الماء ، وضبط درجة الحموضة إلى 7،8 وتقديمهم إلى إجمالي حجم 1 لتر. العازلة للتفاعل Renilla / Coelenterazine العازلة : <ul style="list-style:none;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- وملحوظةس ؛ 13،4 ملي KH 2 PO 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- 86،6 ملي KH 2 PO 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- كلوريد الصوديوم 0،5 M </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -- 1MM EDTA </li></ul> 1 مل ليتر 13،4 استخدام 1M KH 2 ص 4 حل ، 86،6 مل من محلول 1M K 2 4 هبو ، 100ML حل كلوريد الصوديوم و5M 2ml حل EDTA 0،5 م. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td></td><td> شركة </td><td> كتالوج / رقم المنتج : </td></tr><tr><td> DMEM (Dulbecco في التعديل النسر متوسطة 1X) </td><td> GIBCO </td><td> 41966029 </td></tr><tr><td> الجنين الذهب المصل البقري </td><td> PAA </td><td> A15 - 151 </td></tr><tr><td> الأبله المتطرفة جين 9 الحمض النووي ترنسفكأيشن الكاشف </td><td> روش </td><td&gt; 06365809001 </td></tr><tr><td> برنامج تلفزيوني التخزين المؤقت للفوسفات Dulbecco المالحة 1X </td><td> GIBCO </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> اجتماعات الأطراف 3 -- (N - Morpholino) Propanesulfonic حمض </td><td> SIGMA الدريخ </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> سيكلوهيكسيميد </td><td> SIGMA الدريخ </td><td> C7698 </td></tr><tr><td> الاحتياطي السلبي تحلل 5X </td><td> Promega </td><td> E194A </td></tr><tr><td> Glycylglycin EGTA MgSO 4 (4 * MgSO 7H 2 O) </td><td> SIGMA الدريخ روث روث </td><td> G7278 3054.2 P027.1 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 K 2 هبو 4 (K 2 هبو 4 * 3H 2 O) كلوريد الصوديوم EDTA </td><td> روث روث روث روث </td><td> 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 </td></tr><tr><td> Luciferin اليراع </td><td> Biosynth </td><td> L8200 </td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Biosynth </td><td> C7000 </td></tr><tr><td> DTT (Dithiothreitol) </td><td> روث </td><td> 6908.2 </td></tr><tr><td> اعبي التنس المحترفين (الأدينوساين ثلاثي) </td><td> روش </td><td> 10519987001 </td></tr></table>

intracellular refolding assay

يصف هذا البروتوكول وسيلة لقياس النشاط الإنزيمي للمرافقين الجزيئية في نظام خلية القاعدة والآثار المحتملة للمركبات مع النشاط المثبطة / محفزة. المحرمين الجزيئية هي البروتينات المشاركة في التنظيم من البروتين للطي (1) ويكون لها دور حاسم في تعزيز بقاء الخلية على الشتائم الإجهاد مثل الصدمة الحرارية 2 والتجويع المغذيات والتعرض للمواد الكيميائية / السموم 3. لهذا السبب تم العثور على المحرمين أن تشارك في المناسبات مثل التنمية الورم ، chemioresistance الخلايا السرطانية فضلا عن 4 5 تنكس عصبي. تصميم جزيئات صغيرة قادرة على تثبيط أو تحفز نشاط هذه الانزيمات وبالتالي واحدة من أكثر الاستراتيجيات درس لعلاج السرطان والاضطرابات العصبية 7 9. في مقايسة الموصوفة هنا توفر إمكانية لقياس النشاط refolding من كوصي على وجه الخصوص والجزيئية لدراسة تأثير شركاتounds على نشاطها. في هذا الأسلوب هو transfected الجين من كوصي الجزيئية التحقيق مع تعبير لناقلات ترميز الجين luciferase يراعة. وقد وصفته بالفعل يمكن denaturated يراعة luciferase refolded بواسطة المحرمين الجزيئية 10،11. كما تطبيع السيطرة ترنسفكأيشن ، يتم ترميز transfected ناقلات للجينات في luciferase renilla. يتم تنفيذ كافة transfections الموصوفة في هذا البروتوكول مع الأبله المتطرفة جين 11 (روش) في خلايا - 293 كلوة الجنين البشري. في الخطوة الأولى ، يتم منع تصنيع البروتين عن طريق علاج الخلايا مع سيكلوهيكسيميد. بعد ذلك يتم بفعل بروتين الصدمة الحرارية التي تتكشف في 45 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد شفائهم عند 37 درجة مئوية ، ويتم إعادة مطوية البروتينات في التشكل بصورة نشطة ، ويستخدم نشاط luciferase يراعة للقراءة المغادرة : سوف تنتج المزيد من الضوء ، سيكون لديك المزيد من البروتين إعادة التشكل اكتسبت الأصلي. يتم تعيين غير حرارة الخلايا صدمت كمرجع (100 ٪ من refoldedluciferase).

Watch this Scientific Journal Video about Intracellular Refolding Assay at JoVE.com

Intracellular Refolding Assay

في هذا البروتوكول هو وصف طريقة لقياس البروتين داخل الخلايا refolding بعد الصدمة الحرارية. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة foldases مثل المحرمين الجزيئية وتعاونها عوامل أو مركبات قادرة على التأثير على نشاطها. يستخدم يراعة النشاط luciferase كمراسلة لقياس النشاط refolding كوصي.

الخلايا Refolding الفحص

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

قياس الأدنى غشاء البلازما والعالمية حيوية الكالسيوم بين الخلايا في الخلايا النجمية

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

وهناك طريقة للماوس البنكرياس جزيرة العزلة وبين الخلايا المخيم تقدير

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

تصوير الاتجار بين الخلايا من APP مع GFP Photoactivatable

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

الكشف عن التعبير الجيني بين الخلايا في الخلايا الحية من الفئران، الإنسان ولحم الخنزير المنشأ عن طريق النانوية المسمى الإسفار

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

تنقية وRefolding إلى اميلويد الألياف من (صاحب)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged المؤتلف Shadoo البروتين التعبير عن الهيئات إدراج في<em&gt; E. القولونية</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

تحديد بين الخلايا اشارة الأحداث المستحثة في خلايا قابلة للحياة من خلال التفاعل مع المجاورة الخلايا التي تمر أفكارك موت الخلية

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

الرقم الهيدروجيني "الكمي داخل الخلايا" الضوئية في Epithelia نبيب Malpighian melanogaster المورفولوجية مع الرقم الهيدروجيني "الفلورسنت وراثيا" ترميز مؤشر

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

الفيديو خالية من عدسة مجهرية للدينامية والتحليل الكمي للثقافة الخلية ملتصقة

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...