Name: intracellular refolding assay
Uploaded: 2012-01-24T13:00:00
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Danilo Maddalo est récipiendaire d&#39;une bourse de recherche du groupe Young Investigator (YIG) de l&#39;Institut de Technologie de Karlsruhe.

1. Ensemencement des cellules <ol><li> Avant de commencer, faites chauffer le milieu de culture, le PBS 1X et la trypsine dans un bain d&#39;eau à 37 ˚ C </li><li> Prenez les cellules de l&#39;incubateur et aspirer le milieu. </li><li> Appliquez doucement 5 ml de PBS 1X sur les cellules pour les laver. </li><li> Aspirer le PBS 1X et appliquer 1 ml de trypsine EDTA contenant 0,025%. </li><li> Tournez doucement la plaque pour avoir une distribution uniforme de la trypsine. </li><li> Placez les cellules dans l&#39;incu...

<ol>
	<li>Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+and+protein+quality+control.">Molecular chaperones and protein quality control.</a> Cell. 125, 443-443 (2006).</li><li>Ritossa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+heat+shock+response.">Discovery of the heat shock response.</a> Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).</li><li>Hendrick, J. P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperone+functions+of+heat-shock+proteins.">Molecular chaperone functions of heat-shock proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).</li><li>Fuqua, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+proteins+and+drug+resistance.">Heat shock proteins and drug resistance.</a> Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).</li><li>Guzhova, I., Margulis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperone+as+a+survival+factor+in+cell+pathology.">Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology.</a> Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).</li><li>Whitesell, L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90+and+the+chaperoning+of+cancer.">HSP90 and the chaperoning of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG:+mechanisms+of+antitumour+activity.">17-AAG: mechanisms of antitumour activity.</a> Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).</li><li>Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HSP70+for+cancer+therapy.">Targeting HSP70 for cancer therapy.</a> Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).</li><li>Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+provides+neuroprotection+by+reducing+oxidative+stress+and+HSP70+expression+during+chronic+cerebral+hypoperfusion+in+ovariectomized+rats.">Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats.</a> J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).</li><li>Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaK,+DnaJ+and+GrpE+form+a+cellular+chaperone+machinery+capable+of+repairing+heat-induced+protein+damage.">DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage.</a> EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).</li><li>Thulasiraman, V., Matts, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+geldanamycin+on+the+kinetics+of+chaperone-mediated+renaturation+of+firefly+luciferase+in+rabbit+reticulocyte+lysate.">Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate.</a> Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).</li><li>Howarth, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp40+molecules+that+target+to+the+ubiquitin-proteasome+system+decrease+inclusion+formation+in+models+of+polyglutamine+disease.">Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease.</a> Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).</li><li>Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bag1+functions+in+vivo+as+a+negative+regulator+of+Hsp70+chaperone+activity.">Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).</li></ol>

Dans ce travail, un protocole visant à mesurer l&#39;activité de repliement intracellulaire de chaperons moléculaires sont présentés. Le dosage de l&#39;ensemble peut être réalisé en 3 à 4 jours comme indiqué par la vue d&#39;ensemble sur la Fig. 1. La robustesse et la linéarité du signal de la lumière produite par la luciole et la luciférase Renilla représentent une base solide pour la reproductibilité du protocole. L&#39;étape ...

Pour cette expérience «Lumière Vector &#39;une forme Luminomètre Perkin Elmer &#39;1420 compteur de luminescence a été utilisé Programmes pour le luminomètre: Renilla: Pompe 1, injection de 100 ul Reaction Buffer: PUMP1, 70 d&#39;injection ul Luciférine: Pump2, injection 30μl Pour les tampons préparer ces solutions de stock dans de l&#39;eau bidistillée: <ul style="list-style:none"><li> - 1M MgSO 4: 246,48 g MgSO 4 * 7H 2 O dans 1 litre </li><li> - 0,5 M EGTA: 190,18 g dans 1 litre d&#39;EGTA </li><li> - 1M KH 2 PO 4: 136,09 g de KH 2 PO 4 dans 1 litre </li><li> - 1M K2 HPO 4: 228,23 g K 2 HPO 4 * 3 H 2 O dans 1 litre </li><li> - NaCl 5M: 292,2 g de NaCl dans 1 litre </li><li> - 0,5 M d&#39;EDTA: 186,12 g EDTA * 2H 2 O dans 1 litre &nbsp;</li></ul> GLY-GLY-tampon: <ul style="list-style:none"><li> - 25mm Glycylglycin </li><li> - 15mm MgSO 4 </li><li> - 4mm EGTA </li></ul> Pour une utilisation litre 3,3 g de Glycylglycin, 15ml d&#39;une solution 1M MgSO4 et 8ml d&#39;une solution 0,5 M EGTA. Résoudre dans l&#39;eau, ajuster le pH à 7,8 et porter à un volume total de 1 litre. Tampon de réaction pour Renilla / coelentérazine mémoire tampon: <ul style="list-style:none"><li> - &amp; Nbsp; 13,4 mM KH 2 PO 4 </li><li> - 86,6 mM KH 2 PO 4 </li><li> - 0,5 M de NaCl </li><li> - 1mm d&#39;EDTA </li></ul> Pour une utilisation litres 13,4 ml d&#39;une 1M KH 2 PO 4, 86,6 ml d&#39;une 1M K 2 HPO 4 solution, 100 ml d&#39;une solution de NaCl 5M et 2ml d&#39;une solution 0,5 M d&#39;EDTA. <table border="1"><tr><td></td><td> Société </td><td> Catalogue / Numéro de produit: </td></tr><tr><td> DMEM (Dulbecco Modified Eagle Médium 1X) </td><td> GIBCO </td><td> 41966029 </td></tr><tr><td> Or le fœtus de sérum bovin </td><td> AAP </td><td> A15-151 </td></tr><tr><td> X-treme Gene 9 Réactif de transfection d&#39;ADN </td><td> Roche </td><td&gt; 06365809001 </td></tr><tr><td> PBS Phosphate de Dulbecco saline tamponnée 1X </td><td> GIBCO </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> MOPS 3 - (N-morpholino) propane sulfonique </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> C7698 </td></tr><tr><td> Lysis Buffer 5X passif </td><td> Promega </td><td> E194A </td></tr><tr><td> Glycylglycin EGTA MgSO 4 (MgSO 4 * 7H 2 O) </td><td> SIGMA-ALDRICH Roth Roth </td><td> G7278 3054.2 P027.1 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 (K 2 HPO 4 * 3 H 2 O) NaCl EDTA </td><td> Roth Roth Roth Roth </td><td> 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 </td></tr><tr><td> Luciférine Firefly </td><td> Biosynth </td><td> L8200 </td></tr><tr><td> Coelentérazine </td><td> Biosynth </td><td> C7000 </td></tr><tr><td> DTT (dithiothréitol) </td><td> Roth </td><td> 6908.2 </td></tr><tr><td> ATP (adénosine triphosphate) </td><td> Roche </td><td> 10519987001 </td></tr></table>

intracellular refolding assay

Ce protocole décrit une méthode pour mesurer l&#39;activité enzymatique de chaperons moléculaires dans un système basé sur des cellules et les effets possibles des composés ayant une activité inhibitrice / stimulant. Chaperons moléculaires sont des protéines impliquées dans la régulation de repliement des protéines 1 et ont un rôle crucial dans la promotion de la survie des cellules après les insultes de stress comme deux de choc thermique, la famine en éléments nutritifs et l&#39;exposition aux produits chimiques / poisons 3. Pour cette raison, les accompagnateurs sont trouvés d&#39;être impliqués dans des événements comme le développement des tumeurs, chemioresistance de 4 cellules cancéreuses ainsi que la neurodégénérescence 5. Conception de petites molécules capables d&#39;inhiber ou de stimuler l&#39;activité de ces enzymes est donc l&#39;une des stratégies les plus étudiés pour 7 thérapie du cancer et les maladies neurodégénératives 9. Le test décrit ici offre la possibilité de mesurer l&#39;activité de repliement d&#39;un chaperon moléculaire particulière et d&#39;étudier l&#39;effet de la maquetteounds sur son activité. Dans cette méthode, le gène de l&#39;enquête chaperon moléculaire est transfecté avec une vecteur d&#39;expression codant pour le gène de la luciférase de luciole. Il a déjà été décrit que dénaturée luciférase de luciole peut être replié par des chaperons moléculaires 10,11. Comme normaliser le contrôle de transfection, un vecteur codant pour le gène de la luciférase Renilla est transfecté. Toutes les transfections décrites dans ce protocole sont effectués avec X-treme Gene 11 (Roche) dans les cellules HEK-293. Dans la première étape, la synthèse protéique est inhibée par le traitement des cellules avec du cycloheximide. Par la suite, le dépliement des protéines est induite par choc thermique à 45 ° C pendant 30 minutes. Lors de la récupération à 37 ° C, les protéines sont à nouveau repliés dans leur conformation active et l&#39;activité de la luciférase de luciole est utilisé comme lecture: plus la lumière sera produite, le plus de protéines auront regagné la conformation d&#39;origine. Non-thermique cellules choqués sont fixés comme référence (100% des repliéeluciférase).

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Intracellular Refolding Assay

Dans ce protocole, une méthode pour mesurer le repliement des protéines intracellulaires, après choc thermique est décrite. Cette méthode peut être utilisée pour étudier foldases comme chaperons moléculaires et leurs co-facteurs ou des composés capables d&#39;influencer leur activité. Firefly activité luciférase est utilisée en tant que reporter pour mesurer l&#39;activité de repliement chaperon.

Assay Repliement intracellulaire

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Research

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Biology

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Biologie

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