Name: intracellular refolding assay
Uploaded: 2012-01-24T13:00:00
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Danilo Maddalo ist ein Empfänger ein Forschungsstipendium als Young Investigator Group (YIG) aus dem Karlsruhe Institute of Technology.

1. Aussäen der Zellen <ol><li> Bevor Sie beginnen, wärmen das Kulturmedium, das PBS 1X und das Trypsin in einem Wasserbad bei 37 ˚ C </li><li> Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und saugen das Medium. </li><li> Sanft gelten 5 ml PBS 1X auf die Zellen, um sie zu waschen. </li><li> Saugen Sie das PBS 1X und gelten 1 ml Trypsin enthält 0,025% EDTA. </li><li> Vorsichtig dreht die Platte um eine gleichmäßige Verteilung des Trypsin haben. </li><li> Legen Sie die Zellen im Brutschrank bei 37 ˚ C für 5-10 Minuten...

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	<li>Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+and+protein+quality+control.">Molecular chaperones and protein quality control.</a> Cell. 125, 443-443 (2006).</li><li>Ritossa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+heat+shock+response.">Discovery of the heat shock response.</a> Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).</li><li>Hendrick, J. P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperone+functions+of+heat-shock+proteins.">Molecular chaperone functions of heat-shock proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).</li><li>Fuqua, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+proteins+and+drug+resistance.">Heat shock proteins and drug resistance.</a> Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).</li><li>Guzhova, I., Margulis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperone+as+a+survival+factor+in+cell+pathology.">Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology.</a> Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).</li><li>Whitesell, L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90+and+the+chaperoning+of+cancer.">HSP90 and the chaperoning of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG:+mechanisms+of+antitumour+activity.">17-AAG: mechanisms of antitumour activity.</a> Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).</li><li>Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HSP70+for+cancer+therapy.">Targeting HSP70 for cancer therapy.</a> Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).</li><li>Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+provides+neuroprotection+by+reducing+oxidative+stress+and+HSP70+expression+during+chronic+cerebral+hypoperfusion+in+ovariectomized+rats.">Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats.</a> J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).</li><li>Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaK,+DnaJ+and+GrpE+form+a+cellular+chaperone+machinery+capable+of+repairing+heat-induced+protein+damage.">DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage.</a> EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).</li><li>Thulasiraman, V., Matts, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+geldanamycin+on+the+kinetics+of+chaperone-mediated+renaturation+of+firefly+luciferase+in+rabbit+reticulocyte+lysate.">Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate.</a> Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).</li><li>Howarth, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp40+molecules+that+target+to+the+ubiquitin-proteasome+system+decrease+inclusion+formation+in+models+of+polyglutamine+disease.">Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease.</a> Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).</li><li>Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bag1+functions+in+vivo+as+a+negative+regulator+of+Hsp70+chaperone+activity.">Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).</li></ol>

In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur intrazellulären Rückfaltung Aktivität der molekularen Chaperone Maßnahme vorgestellt. Der ganze Test kann in 3 bis 4 Tagen durchgeführt werden, wie die Übersicht in Abb. gezeigt. 1. Die Robustheit und Linearität des Lichtsignals durch die Glühwürmchen und die Renilla-Luciferase produziert stellen eine solide Basis für die Reproduzierbarkeit des Protokolls. Der entscheidende Schritt des Tests ist d...

Aus diesem Experiment wurde ein Luminometer Form Perkin Elmer &#39;1420 Lumineszenz Counter &#39;Vector Light&#39; wurde verwendet, Programme für das Luminometer: Renilla: Pumpe 1, 100 ul Injektion Reaction Buffer: Pump1, 70 ul Injektion Luciferin: Pumpe2, 30μl Injektion Für die Puffer bereiten diese Stammlösungen in doppelt destilliertem Wasser: <ul style="list-style:none"><li> - 1M MgSO 4: 246,48 g MgSO 4 * 7H 2 O in 1 Liter </li><li> - 0,5 M EGTA: 190,18 g EGTA in 1 Liter </li><li> - 1M KH 2 PO 4: 136,09 g KH 2 PO 4 in 1 Liter </li><li> - 1M K2 HPO 4: 228,23 g K 2 HPO 4 * 3H 2 O in 1 Liter </li><li> - 5M NaCl: 292,2 g NaCl in 1 Liter </li><li> - 0,5 M EDTA: 186,12 g EDTA · 2H 2 O in 1 Liter &nbsp;</li></ul> Gly-Gly-Puffer: <ul style="list-style:none"><li> - 25mm Glycylglycin </li><li> - 15mm MgSO 4 </li><li> - 4mm EGTA </li></ul> Für 1 Liter Einsatz 3,3 g Glycylglycin, 15ml einer 1M MgSO4-Lösung und 8ml einer 0,5 M EGTA-Lösung. Lösen in Wasser, pH-Wert auf 7,8 und bringen bis zu einem Gesamtvolumen von 1 Liter. Reaktionspuffer für Renilla / Coelenterazin Puffer: <ul style="list-style:none"><li> - &amp; Nbsp; 13,4 mM KH 2 PO 4 </li><li> - 86,6 mM KH 2 PO 4 </li><li> - 0,5 M NaCl </li><li> - 1mM EDTA </li></ul> Für 1 Liter nutzen 13,4 ml einer 1M KH 2 PO 4-Lösung, 86,6 ml einer 1M K 2 HPO 4-Lösung, 100ml einer 5M NaCl-Lösung und 2 ml einer 0,5 M EDTA-Lösung. <table border="1"><tr><td></td><td> Firma </td><td> Katalog / Artikelnummer: </td></tr><tr><td> DMEM (Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium 1X) </td><td> GIBCO </td><td> 41966029 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum Gold- </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td></tr><tr><td> X-treme Gene 9 DNA Transfektionsreagenz </td><td> Roche </td><td&gt; 06365809001 </td></tr><tr><td> PBS Dulbeccos Phosphate Buffered Saline 1X </td><td> GIBCO </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> MOPS 3 - (N-Morpholino) propansulfonsäure </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Cycloheximid </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> C7698 </td></tr><tr><td> Passive Lysis Buffer 5X </td><td> Promega </td><td> E194A </td></tr><tr><td> Glycylglycin EGTA MgSO 4 (MgSO 4 * 7H 2 O) </td><td> SIGMA-ALDRICH Roth Roth </td><td> G7278 3054,2 P027.1 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 (K 2 HPO 4 * 3H 2 O) NaCl EDTA </td><td> Roth Roth Roth Roth </td><td> 3904,1 6878,2 3957,1 8043,1 </td></tr><tr><td> Luciferin Firefly </td><td> Biosynth </td><td> L8200 </td></tr><tr><td> Coelenterazin </td><td> Biosynth </td><td> C7000 </td></tr><tr><td> DTT (Dithiothreitol) </td><td> Roth </td><td> 6908,2 </td></tr><tr><td> ATP (Adenosin Triphosphat) </td><td> Roche </td><td> 10519987001 </td></tr></table>

intracellular refolding assay

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um die enzymatische Aktivität der molekularen Chaperone in der Zelle-basierten System und die möglichen Auswirkungen von Verbindungen mit inhibitorischen / stimulierende Aktivität zu messen. Molekulare Chaperone sind Proteine, die bei der Regulation der Proteinfaltung 1 beteiligt und spielen eine entscheidende Rolle bei der Förderung der das Überleben der Zelle auf Stress Beleidigungen wie Hitzeschock 2, Nährstoff Hunger und die Exposition gegenüber Chemikalien / Gifte 3. Aus diesem Grund Chaperone gefunden werden, um in Veranstaltungen wie Tumor-Entwicklung, chemioresistance von Krebszellen 4 sowie Neurodegeneration 5 beteiligten werden. Design von kleinen Molekülen in der Lage zu hemmen oder stimulieren die Aktivität dieser Enzyme ist daher eine der am besten untersuchten Strategien zur Krebstherapie 7 und neurodegenerativen Erkrankungen 9. Der Test hier beschrieben bietet die Möglichkeit, die Rückfaltung Aktivität eines bestimmten molekularen Chaperon zu messen und die Wirkung von comp-Studieounds über ihre Tätigkeit. Bei dieser Methode wird das Gen des molekularen Chaperon untersucht wird zusammen mit einem Expressionsvektor kodiert für die Firefly-Luciferase-Gen transfiziert. Es wurde bereits beschrieben, dass denaturierte Luciferase durch molekulare Chaperone 10,11 kann gefaltet. Als Normalisierung Transfektion kontrollieren, ist ein Vektor-Codierung für die Renilla-Luciferase-Gen transfiziert. Alle Transfektionen in diesem Protokoll beschriebenen sind mit X-treme Gene 11 (Roche) in HEK-293 Zellen durchgeführt. Im ersten Schritt wird die Proteinsynthese durch Behandlung der Zellen mit Cycloheximid gehemmt. Danach Proteinentfaltung wird durch Hitzeschock bei 45 ° C für 30 Minuten induziert. Nach Wiederaufnahme bei 37 ° C, sind Proteine ​​wieder zusammengefaltet in ihre aktive Konformation und Aktivität der Firefly-Luciferase als read-out verwendet: je mehr Licht produziert wird, desto mehr Protein wird die ursprüngliche Konformation wieder gewonnen. Non-Hitzeschock-Zellen sind als Referenz (100% des refolded gesetztLuciferase).

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Intracellular Refolding Assay

In diesem Protokoll eine Methode, um intrazelluläre Protein Rückfaltung nach Hitzeschock Maßnahme beschrieben. Diese Methode kann verwendet werden, um foldases wie molekulare Chaperone und ihr Co-Faktoren oder Verbindungen in der Lage, ihre Tätigkeit Einfluss zu studieren. Firefly Luciferase-Aktivität wird als Reporter Chaperon Rückfaltung Aktivität zu messen.

Intrazelluläre Rückfaltung Assay

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Messen in der Nähe Plasmamembran und Global intrazellulären Calcium-Dynamics in Astrozyten

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Forschung

Biologie

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Abbilden des intrazellulären Transport von APP mit Photoaktivierbare GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Der Nachweis von intrazellulären Genexpression in lebenden Zellen der Maus, Mensch und Schwein Origin Mit Fluoreszenz-markierter Nanopartikel

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

Reinigung und Rückfaltung an Amyloidfibrillen von (His)<sub&gt; 6</sub&gt; -markierte Recombinant Protein Shadoo als Einschlusskörper in Ausgedrückt<em&gt; E. coli</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Identifizierung von intrazellulärer Induzierte in lebenden Zellen durch Interaktion Signalisierung mit Benachbarte Zellen, die eine programmierten Zelltods

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Optische Quantifizierung der intrazellulären pH in Drosophila Melanogaster Malpighian Röhrchen Epithelien mit einem fluoreszierenden genetisch codierte pH Indikator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Objektiv-kostenlose Videomikroskopie für die Dynamik und Quantitative Analyse der adhärente Zellkultur

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...