Name: intracellular refolding assay
Uploaded: 2012-01-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intracellular Refolding Assay at JoVE.com

דנילו מדלו הוא מקבל מלגת מחקר כמו קבוצת לחוקר הצעיר (YIG) מהמכון הטכנולוגי של קרלסרוהה.

1. מתזמן את התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחילים, לחמם את המדיום תרבות, 1X PBS ואת טריפסין באמבט מים 37 ˚ C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את התאים מתוך החממה לשאוב את המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להחיל 5 מ&quot;ל של PBS 1X על התאים כד?...

<ol>
	<li>Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+and+protein+quality+control.">Molecular chaperones and protein quality control.</a> Cell. 125, 443-443 (2006).</li><li>Ritossa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+heat+shock+response.">Discovery of the heat shock response.</a> Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).</li><li>Hendrick, J. P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperone+functions+of+heat-shock+proteins.">Molecular chaperone functions of heat-shock proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).</li><li>Fuqua, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+proteins+and+drug+resistance.">Heat shock proteins and drug resistance.</a> Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).</li><li>Guzhova, I., Margulis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperone+as+a+survival+factor+in+cell+pathology.">Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology.</a> Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).</li><li>Whitesell, L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90+and+the+chaperoning+of+cancer.">HSP90 and the chaperoning of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG:+mechanisms+of+antitumour+activity.">17-AAG: mechanisms of antitumour activity.</a> Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).</li><li>Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HSP70+for+cancer+therapy.">Targeting HSP70 for cancer therapy.</a> Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).</li><li>Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+provides+neuroprotection+by+reducing+oxidative+stress+and+HSP70+expression+during+chronic+cerebral+hypoperfusion+in+ovariectomized+rats.">Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats.</a> J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).</li><li>Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaK,+DnaJ+and+GrpE+form+a+cellular+chaperone+machinery+capable+of+repairing+heat-induced+protein+damage.">DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage.</a> EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).</li><li>Thulasiraman, V., Matts, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+geldanamycin+on+the+kinetics+of+chaperone-mediated+renaturation+of+firefly+luciferase+in+rabbit+reticulocyte+lysate.">Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate.</a> Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).</li><li>Howarth, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp40+molecules+that+target+to+the+ubiquitin-proteasome+system+decrease+inclusion+formation+in+models+of+polyglutamine+disease.">Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease.</a> Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).</li><li>Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bag1+functions+in+vivo+as+a+negative+regulator+of+Hsp70+chaperone+activity.">Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).</li></ol>

בעבודה זו בפרוטוקול כדי למדוד את פעילות refolding תאיים של מלווים מולקולרית מוצג. Assay כולו ניתן לבצע 3 עד 4 ימים כפי שמוצג על ידי סקירה של איור. 1. עמידות ליניאריות של אות אור המיוצר על ידי גחלילית ואת בלוציפראז renilla מהווים בסיס ?...

לצורך ניסוי זה &quot;אור וקטור&quot; צורה Luminometer פרקין אלמר &#39;1420 הארה מונה שימשה תוכניות Luminometer: Renilla: משאבה 1, 100 הזרקה μl מאגר התגובה: Pump1, 70 הזרקה μl Luciferin: Pump2, הזרקת 30μl עבור מאגרים להכין פתרונות אלו המניות מים מזוקקים כפול: <ul style="list-style:none;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 1M MgSO 4: 246,48 גרם MgSO 4 * 7H 2 O ב 1 ליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 0,5 M EGTA: 190,18 גרם EGTA ב 1 ליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 1M KH 2 PO 4: 136,09 גרם KH 2 PO 4 ב 1 ליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 1M K2 HPO 4: 228,23 גרם K 2 HPO 4 * 3H 2 O ב 1 ליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - NaCl 5M: 292,2 גרם NaCl ב 1 ליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 0,5 M EDTA: 186,12 גרם EDTA * 2H 2 O ב 1 ליטר &nbsp;</li></ul> גלאי, גלאי-חיץ: <ul style="list-style:none;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 25mm Glycylglycin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 15mm MgSO 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 4 מ&quot;מ EGTA </li></ul> עבור 1 ליטר להשתמש 3,3 גרם Glycylglycin, 15 מ&quot;ל של פתרון MgSO4 1M ו 8ml של פתרון 0,5 EGTA ז. לפתור במים, כדי להתאים את pH 7,8 ומביאים בהיקף כולל של 1 ליטר. תגובת חיץ חיץ עבור Renilla / Coelenterazine: <ul style="list-style:none;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - &amp; Nbsp; 13,4 mM KH 2 PO 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 86,6 mM KH 2 PO 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 0.5 M NaCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 1mm EDTA </li></ul> עבור 1 מ&quot;ל להשתמש 13,4 ליטר פתרון 1M KH 2 PO 4, 86,6 מ&quot;ל של פתרון 1M K 2 HPO 4, 100 מ&quot;ל של תמיסת NaCl 2ml 5M של פתרון 0.5 EDTA M. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td></td><td> חברה </td><td> קטלוג / מספר מוצר: </td></tr><tr><td> DMEM (השתנה Dulbecco הנשר בינוני 1X) </td><td> GIBCO </td><td> 41966029 </td></tr><tr><td> עוברית זהב בסרום שור </td><td> PAA </td><td> ת 15-151 </td></tr><tr><td> X-treme ג&#39;ין 9 Transfection DNA מגיב </td><td> רוש </td><td&gt; 06365809001 </td></tr><tr><td> PBS פוספט של Dulbecco בופר 1X </td><td> GIBCO </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> מגבים 3 - (N-Morpholino) Propanesulfonic חומצה </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7698 </td></tr><tr><td> תמוגה הצפת פסיבי 5X </td><td> Promega </td><td> E194A </td></tr><tr><td> Glycylglycin EGTA MgSO 4 (4 * MgSO 7H 2 O) </td><td> Sigma-Aldrich רוט רוט </td><td> G7278 3054.2 P027.1 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 (K 2 HPO 4 * 3H 2 O) NaCl EDTA </td><td> רוט רוט רוט רוט </td><td> 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 </td></tr><tr><td> Luciferin Firefly </td><td> ביוסינט </td><td> L8200 </td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> ביוסינט </td><td> C7000 </td></tr><tr><td> DTT (Dithiothreitol) </td><td> רוט </td><td> 6908.2 </td></tr><tr><td> ה-ATP (אדנוזין טריפוספט) </td><td> רוש </td><td> 10519987001 </td></tr></table>

intracellular refolding assay

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי למדוד את הפעילות האנזימטית של מלווים מולקולרית במערכת התא מבוסס ואת ההשפעות האפשריות של תרכובות בעלות פעילות המעכבת / מגרה. מלווים מולקולרית הם חלבונים המעורבים בוויסות של החלבון המתקפל 1 יש תפקיד מכריע בקידום ההישרדות תא הלחץ על עלבונות כמו מכת חום 2, רעב מזין וחשיפה לכימיקלים / רעלים 3. מסיבה זו מלווים הם מצאו להיות מעורבים באירועים כמו התפתחות הגידול, chemioresistance של 4 תאים סרטניים, כמו גם ניוון מוחיים 5. עיצוב של מולקולות קטנות מסוגל לעכב או להמריץ את הפעילות של אנזימים אלה ולכן הוא אחת האסטרטגיות ביותר למד לטיפול בסרטן ומחלות ניווניות 7 9. Assay המתואר כאן מציע את האפשרות למדוד את פעילות refolding של המלווה מולקולרי מסוים ללמוד את ההשפעה של compounds על פעילותה. בשיטה זו הגן של המלווה המולקולרי הוא נחקר transfected יחד עם קידוד ביטוי עבור וקטור הגן בלוציפראז גחלילית. היא תוארה כבר denaturated בלוציפראז גחלילית ניתן וקיפלתי על ידי מלווים מולקולרית 10,11. כמו נורמליזציה מלאה transfection, קידוד וקטור עבור הגן בלוציפראז renilla הוא transfected. Transfections כל המתואר בפרוטוקול זה מבוצעות עם X-treme ג&#39;ין 11 (Roche) ב HEK-293 תאים. בשלב הראשון, סינתזת החלבון היא מעוכבת על ידי טיפול בתאי עם cycloheximide. לאחר מכן חלבון התגלגלות הוא המושרה על ידי הלם חום 45 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר התאוששות ב 37 ° C, חלבונים מחדש מקופל לתוך קונפורמציה פעילה שלהם את הפעילות של בלוציפראז גחלילית משמש לקריאה מתוך: האור יותר יופק, החלבון יותר יהיה מחדש זכתה קונפורמציה המקורי. ללא חום תאים בהלם מוגדרות כנקודת התייחסות (100% מכלל וקיפלתיבלוציפראז).

Watch this Scientific Journal Video about Intracellular Refolding Assay at JoVE.com

Intracellular Refolding Assay

בפרוטוקול בשיטה זו כדי למדוד refolding חלבון תאיים לאחר הלם החום מתואר. שיטה זו יכולה לשמש כדי ללמוד foldases כמו מלווים המולקולרית שלהם שיתוף גורמים או תרכובות מסוגל להשפיע על פעילותם. פעילות גחלילית בלוציפראז משמש ככתב למדוד refolding פעילות המלווה.

שב וקיפל תאיים Assay

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

מדידת הקרוב ממברנה פלזמה ו Global Dynamics סידן תאיים בתוך האסטרוציטים

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

הדמיה הסחר תאיים של APP עם GFP Photoactivatable

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

זיהוי של ביטוי גנים בתאים תאיים חיים של Murine, אדם וחזירי מקור באמצעות חלקיקים שכותרתו פלואורסצנטי

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

טיהור וקפל שוב לעמילואיד סיבים של (שלו)<sub&gt; 6</sub&gt; חלבון רקומביננטי Shadoo -tagged מבוטא גופי הכללה ב<em&gt; חיידק</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

זיהוי של איתות תאיים אירועים מושרה תאים קיימא על ידי אינטראקציה עם תאים שכנים מוות של תאים אפופטוטיים שעברו

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

PH כימות של תאיים אופטי בדרוזופילה melanogaster צנורית Malpighian Epithelia עם pH מקודד פלורסנט גנטית מחוון

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

ללא עדשה מיקרוסקופ וידאו עבור הדינמיקה וניתוח כמותי של תרבית תאים חסיד

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...