Name: intracellular refolding assay
Uploaded: 2012-01-24T13:00:00
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다닐 Maddalo 기술의 카를 스루에 연구소에서 젊은 탐정 그룹 (YIG)와 같은 연구 활동의받는 사람입니다.

1. 세포를 심는 <ol><li> 시작하기 전에, 37에서 물을 욕조에있는 문화 매체, PBS 1X와 트립신을 따뜻하게 ˚ C </li><li> 인큐베이터 밖으로 세포를 가지고 매체를 기음. </li><li> 부드럽게 그들을 씻어 세포에 PBS 1X의 5 ML을 적용합니다. </li><li> PBS 1X를 기음과 트립신은 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0,025퍼센트를 포함하는 1 ML을 적용합니다. </li><li> 부드럽게 트립신의 균등을 접시를 회전. </li><li> 37 ?...

<ol>
	<li>Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+and+protein+quality+control.">Molecular chaperones and protein quality control.</a> Cell. 125, 443-443 (2006).</li><li>Ritossa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+heat+shock+response.">Discovery of the heat shock response.</a> Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).</li><li>Hendrick, J. P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperone+functions+of+heat-shock+proteins.">Molecular chaperone functions of heat-shock proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).</li><li>Fuqua, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+proteins+and+drug+resistance.">Heat shock proteins and drug resistance.</a> Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).</li><li>Guzhova, I., Margulis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperone+as+a+survival+factor+in+cell+pathology.">Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology.</a> Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).</li><li>Whitesell, L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90+and+the+chaperoning+of+cancer.">HSP90 and the chaperoning of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG:+mechanisms+of+antitumour+activity.">17-AAG: mechanisms of antitumour activity.</a> Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).</li><li>Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HSP70+for+cancer+therapy.">Targeting HSP70 for cancer therapy.</a> Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).</li><li>Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+provides+neuroprotection+by+reducing+oxidative+stress+and+HSP70+expression+during+chronic+cerebral+hypoperfusion+in+ovariectomized+rats.">Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats.</a> J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).</li><li>Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaK,+DnaJ+and+GrpE+form+a+cellular+chaperone+machinery+capable+of+repairing+heat-induced+protein+damage.">DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage.</a> EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).</li><li>Thulasiraman, V., Matts, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+geldanamycin+on+the+kinetics+of+chaperone-mediated+renaturation+of+firefly+luciferase+in+rabbit+reticulocyte+lysate.">Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate.</a> Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).</li><li>Howarth, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp40+molecules+that+target+to+the+ubiquitin-proteasome+system+decrease+inclusion+formation+in+models+of+polyglutamine+disease.">Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease.</a> Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).</li><li>Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bag1+functions+in+vivo+as+a+negative+regulator+of+Hsp70+chaperone+activity.">Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).</li></ol>

이 작품에서는 분자 보호자의 세포내 refolding 활동을 측정하는 프로토콜이 제공됩니다. 그림의 개요에 의해 그림과 같이 전체 분석은 3-4일에서 수행할 수 있습니다. 1. 반딧불과 renilla 루시페라제에 의해 만들어진 빛의 신호의 견고하고 선형이 프로토콜의 재현성위한 견고한 기반을 나타냅니다. 분석의 중요한 단계는 분자 보호...

본 실험에서는 Luminometer 양식 Perkin 엘머 &#39;1420 발광 카운터 &#39;벡터 라이트&#39;가 사용되었다 Luminometer를위한 프로그램 : Renilla : 펌프 1, 100 μl 주입 반응 버퍼 : Pump1, 70 μl 주입 Luciferin : Pump2, 30μl 주입 버퍼는 두 번 증류수에서 이러한 재고 솔루션을 준비 경우 : <ul style="list-style:none"><li> - 1M MgSO 4 : 일리터에서 246,48 g MgSO 4 * 7H 2 O </li><li> - 0,5 M EGTA : 일리터에서 190,18 g EGTA </li><li> - 1M KH 2 PO 4 : 일리터에서 136,09 g KH 2 PO 4 </li><li> - 1M K2 HPO 4 : 228,23 g K 2 HPO 일리터 4 * 3H 2 O </li><li> - 5M NaCl : 일리터에서 292,2 g NaCl </li><li> - 0,5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) : 일리터에서 186,12 g EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) * 2 시간 2 O &nbsp;</li></ul> GLY - GLY 버퍼 : <ul style="list-style:none"><li> - 25mM Glycylglycin </li><li> - 15mM MgSO 4 </li><li> - 4mm짜리 EGTA </li></ul> 에 대한 Glycylglycin의 1리터 사용 3,3 g, MgSO4 1M 솔루션과 0,5 M EGTA 솔루션의 8ml의 15ml. 물에 해결, 7,8로 산도를 조정 1 리터의 총 볼륨에 가져와. Renilla / Coelenterazine 버퍼에 대한 반응 완충액 : <ul style="list-style:none"><li> - &amp; NBSP, 13,4 MM KH 2 PO 4 </li><li> - 86,6 MM KH 2 PO 4 </li><li> - 0,5 M NaCl </li><li> - 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </li></ul> 1M KH 2 PO 4 용액의 1리터 사용 13,4 ML 들어, 0,5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션의 5M NaCl 솔루션과 2ml의 100ml 1M K 2 HPO 4 용액의 86,6 ML. <table border="1"><tr><td></td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 / 제품 수량 : </td></tr><tr><td> DMEM (Dulbecco의 수정된 이글 중간 1X) </td><td> GIBCO </td><td> 41966029 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 골드 </td><td> PAA </td><td> A15 - 151 </td></tr><tr><td> X - treme 진 구 DNA의 Transfection 시약 </td><td> 호슈 </td><td&gt; 06365809001 </td></tr><tr><td> PBS Dulbecco의 인산은 식염수 1X를 버퍼 </td><td> GIBCO </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> 맙스 3 - (N - Morpholino) Propanesulfonic 산성 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> C7698 </td></tr><tr><td> 수동적 용해 완충액 5 배 </td><td> Promega </td><td> E194A </td></tr><tr><td> Glycylglycin EGTA MgSO 4 (MgSO 4 * 7H 2 O) </td><td> 시그마 - 올드 리치 로스 로스 </td><td> G7278 3054.2 P027.1 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 (K 2 HPO 4 * 3H 2 O) NaCl EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 로스 로스 로스 로스 </td><td> 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 </td></tr><tr><td> Luciferin 반딧불 </td><td> Biosynth </td><td> L8200 </td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Biosynth </td><td> C7000 </td></tr><tr><td> DTT (Dithiothreitol) </td><td> 로스 </td><td> 6908.2 </td></tr><tr><td> ATP (아데노신 Triphosphate) </td><td> 호슈 </td><td> 10519987001 </td></tr></table>

intracellular refolding assay

이 프로토콜은 셀 기반 시스템 및 억제 / 자극 활동 화합물의 가능한 영향의 분자 보호자의 효소 활동을 측정하는 방법을 설명합니다. 분자 보호자는 1 접는 단백질의 조절에 관여 단백질이며 열충격 2, 영양 기아와 화학 물질 / 독극물 3 노출과 같은 스트레스를 모욕시 세포 생존을 증진에 중요한 역할을했습니다. 이러한 이유로 보호자는 종양이 개발, 암 세포 4 chemioresistance뿐만 아니라 neurodegeneration 5와 같은 행사에 참여하기 위해 볼 수 있습니다. 이러한 효소의 활동을 억제하거나 자극하는 작은 분자 수있는 디자인 따라서 암 치료 7 neurodegenerative 장애 9 가장 공부 전략 중 하나입니다. 여기에서 설명한 분석은 특정 분자 보호자의 refolding 활동을 측정하고 광고의 효과를 연구하기위한 가능성을 제공합니다그 활동 ounds. 이 방법에서는 조사 분자 보호자의 유전자는 반딧불 루시페라제 유전자에 대한 발현 벡터 인코딩과 함께 transfected이다. 그것은 이미 denaturated 반딧불 루시페라제이 분자 보호자 10,11으로 refolded 수 있습니다 설명했습니다. transfection 제어를 정규화로 renilla 루시페라제 유전자에 대한 벡터 인코딩 transfected이다. 이 프로토콜에 설명된 모든 transfections는 HEK - 293 세포에서 X - treme 진 11 (Roche는)로 수행됩니다. 첫 번째 단계에서 단백질 합성은 cycloheximide와 세포를 치료에 의해 저해됩니다. 이후 전개 단백질은 30 분 동안 45 ° C에서 열 충격에 의해 유발됩니다. 37 복구시 ° C는 단백질이 다시 접혀들의 적극적인 형태로와 반딧불의 루시페라제의 활동이 읽기 - 아웃로 사용됩니다 더욱 빛이 생산되고, 더 많은 단백질이 원래의 형태를 다시 놓이게됩니다. 비 열 충격 전지 참조 (refolded 100 %로 설정됩니다루시페라제).

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Intracellular Refolding Assay

이 프로토콜의 열충격 후 세포내 단백질 refolding을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 활동에 영향을 미칠 수있는 분자 보호자 및 공동 요소 또는 혼합물과 같은 foldases을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 반딧불 루시페라제 활동은 보호자 역할 refolding 활동을 측정하는 기자로 사용됩니다.

세포 Refolding 분석

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Astrocytes의 플라즈마 막 글로벌 세포내 칼슘 역학 니어 측정

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

연구

생물학

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

광활성 GFP와 응용 프로그램의 세포 내 인신 매매 이미징

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

형광 표지 된 나노 입자를 사용하여 쥐, 인간과 돼지 유래의 살아있는 세포에서 세포 내 유전자 발현의 검출

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

정제 및 아밀로이드 피 브릴로 리 폴딩 (그의)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged 재조합 Shadoo 단백질의 봉입체로 표현<em&gt; 대장균</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

세포 내 이웃 셀을받은 사멸 세포 죽음과의 상호 작용에 의해 실행 가능한 세포에서 유도 된 이벤트를 시그널링의 식별

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

형광 유전자 인코딩 ph 지시자 초파리 melanogaster 말 관 Epithelia에 광학 정량화의 세포내 pH

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

동적에 대 한 렌즈 무료 비디오 현미경 및 부착 세포 배양의 정량 분석

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...