Name: intracellular refolding assay
Uploaded: 2012-01-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intracellular Refolding Assay at JoVE.com

Danilo Maddalo er en mottaker av en stipendiatstilling som Young Investigator Group (YIG) fra Karlsruhe Institute of Technology.

1. Seeding cellene <ol><li> Før du begynner, varm opp kulturen medium, PBS 1X og trypsin i et vannbad ved 37 ˚ C </li><li> Ta cellene ut av inkubatoren og aspirer mediet. </li><li> Forsiktig gjelder 5 ml PBS 1X på cellene for å vaske dem. </li><li> Aspirer PBS 1X og gjelder 1 mL trypsin inneholder 0025% EDTA. </li><li> Forsiktig rotere plate til å ha en jevn fordeling av trypsin. </li><li> Plasser cellene i inkubator ved 37 ˚ C i 5-10 minutter (avhengig av celletype). Fra tid til annen se om cellene er frittligg...

<ol>
	<li>Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+and+protein+quality+control.">Molecular chaperones and protein quality control.</a> Cell. 125, 443-443 (2006).</li><li>Ritossa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+heat+shock+response.">Discovery of the heat shock response.</a> Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).</li><li>Hendrick, J. P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperone+functions+of+heat-shock+proteins.">Molecular chaperone functions of heat-shock proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).</li><li>Fuqua, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+proteins+and+drug+resistance.">Heat shock proteins and drug resistance.</a> Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).</li><li>Guzhova, I., Margulis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperone+as+a+survival+factor+in+cell+pathology.">Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology.</a> Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).</li><li>Whitesell, L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90+and+the+chaperoning+of+cancer.">HSP90 and the chaperoning of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG:+mechanisms+of+antitumour+activity.">17-AAG: mechanisms of antitumour activity.</a> Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).</li><li>Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HSP70+for+cancer+therapy.">Targeting HSP70 for cancer therapy.</a> Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).</li><li>Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+provides+neuroprotection+by+reducing+oxidative+stress+and+HSP70+expression+during+chronic+cerebral+hypoperfusion+in+ovariectomized+rats.">Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats.</a> J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).</li><li>Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaK,+DnaJ+and+GrpE+form+a+cellular+chaperone+machinery+capable+of+repairing+heat-induced+protein+damage.">DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage.</a> EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).</li><li>Thulasiraman, V., Matts, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+geldanamycin+on+the+kinetics+of+chaperone-mediated+renaturation+of+firefly+luciferase+in+rabbit+reticulocyte+lysate.">Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate.</a> Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).</li><li>Howarth, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp40+molecules+that+target+to+the+ubiquitin-proteasome+system+decrease+inclusion+formation+in+models+of+polyglutamine+disease.">Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease.</a> Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).</li><li>Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bag1+functions+in+vivo+as+a+negative+regulator+of+Hsp70+chaperone+activity.">Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).</li></ol>

I dette arbeidet en protokoll for å måle intracellulære refolding aktivitet av molekylære anstand presenteres. Hele analysen kan utføres i 3 til 4 dager slik det fremkommer av oversikten i fig. 1. Robusthet og linearitet av lyset signal produsert av ildflue og renilla luciferase representerer en solid base for reproduserbarheten av protokollen. Den kritiske trinn i analysen er valget av en effektiv transfeksjon reagens å sikre overekspresjo...

For dette eksperimentet en luminometer skjema Perkin Elmer &#39;1420 Luminescence Counter &#39;Vector Light &quot;ble brukt Programmer for luminometer: Renilla: 1 Pumpe, 100 mL injeksjon Reaksjonsbuffer: Pump1, 70 mL injeksjon Luciferin: Pump2, 30μl injeksjon For bufferne forberede disse stamløsninger i dobbelt destillert vann: <ul style="list-style:none"><li> - 1M MgSO 4: 246,48 g MgSO 4 * 7H 2 O i 1 liter </li><li> - 0,5 M EGTA: 190,18 g EGTA i 1 liter </li><li> - 1M KH 2 PO 4: 136,09 g KH 2 PO 4 i 1 liter </li><li> - 1M K2 HPO 4: 228,23 g K 2 HPO 4 * 3H 2 O i 1 liter </li><li> - 5M NaCl: 292,2 g NaCl i 1 liter </li><li> - 0,5 M EDTA: 186,12 g EDTA * 2H 2 O i 1 liter &nbsp;</li></ul> Gly-Gly-buffer: <ul style="list-style:none"><li> - 25mm Glycylglycin </li><li> - 15mm MgSO 4 </li><li> - 4mm EGTA </li></ul> For 1 liter bruker 3,3 g Glycylglycin, 15ml av en 1M MgSO4 løsning og 8ml av en 0,5 M EGTA løsning. Løs i vann, juster pH til 7,8 og bringe til et totalt volum på 1 liter. Reaction buffer for Renilla / Coelenterazine buffer: <ul style="list-style:none"><li> - &amp; Nbsp; 13,4 mM KH 2 PO 4 </li><li> - 86,6 mM KH 2 PO 4 </li><li> - 0,5 M NaCl </li><li> - 1mm EDTA </li></ul> For 1 liter bruke 13,4 ml 1M KH 2 PO 4 løsning, 86,6 ml 1M K 2 HPO 4 løsning, 100ml av en 5M NaCl-løsning og 2 ml av en 0,5 M EDTA løsning. <table border="1"><tr><td></td><td> Firma </td><td> Catalog / Product Number: </td></tr><tr><td> DMEM (Dulbecco modifiserte Eagle Medium 1X) </td><td> GIBCO </td><td> 41966029 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum Gold </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td></tr><tr><td> X-treme Gene 9 DNA Transfeksjon Reagens </td><td> Roche </td><td&gt; 06365809001 </td></tr><tr><td> PBS Dulbecco er Fosfatbufret Saline 1X </td><td> GIBCO </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> Mopper 3 - (N-Morpholino) Propanesulfonic syre </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> C7698 </td></tr><tr><td> Passive Lysis Buffer 5X </td><td> Promega </td><td> E194A </td></tr><tr><td> Glycylglycin EGTA MgSO 4 (MgSO 4 * 7H 2 O) </td><td> SIGMA-ALDRICH Roth Roth </td><td> G7278 3054.2 P027.1 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 (K 2 HPO 4 * 3H 2 O) NaCl EDTA </td><td> Roth Roth Roth Roth </td><td> 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 </td></tr><tr><td> Luciferin Firefly </td><td> Biosynth </td><td> L8200 </td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Biosynth </td><td> C7000 </td></tr><tr><td> DTT (ditiotreitol) </td><td> Roth </td><td> 6908.2 </td></tr><tr><td> ATP (adenosin trifosfat) </td><td> Roche </td><td> 10519987001 </td></tr></table>

intracellular refolding assay

Denne protokollen beskriver en metode for å måle enzymatisk aktivitet av molekylære anstand i en celle-basert system, og mulige effekter av forbindelser med hemmende / stimulerende aktivitet. Molecular anstand er proteiner involvert i regulering av protein folding 1 og har en avgjørende rolle i å fremme celle overlevelse ved stresset fornærmelser som heat shock 2, nærings sult og eksponering for kjemikalier / giftstoffer 3. Av denne grunn anstand er funnet å være involvert i hendelser som tumor utvikling, chemioresistance av kreft celler 4 samt neurodegeneration 5. Design av små molekyler i stand til å hemme eller stimulere aktiviteten av disse enzymene er derfor en av de mest studerte strategier for kreftbehandling 7 og nevrodegenerative lidelser 9. Analysen her er beskrevet gir muligheten til å måle refolding aktiviteten til et bestemt molekylær anstand og å studere effekten av compounds på sin virksomhet. I denne metoden genet av molekylære anstand undersøkt er transfektert sammen med et uttrykk vektor koding for ildfluen luciferase genet. Det er allerede beskrevet som denaturated ildflue luciferase kan refolded av molekylær anstand 10,11. Som normalisering transfeksjon kontroll, er en vektor koding for renilla luciferase genet transfektert. Alle transfections beskrevet i denne protokollen er utført med X-treme Gene 11 (Roche) i HEK-293 celler. I det første trinnet, er proteinsyntesen hemmes ved å behandle cellene med cycloheximide. Deretter protein unfolding er indusert av varme sjokk ved 45 ° C i 30 minutter. Ved utvinning ved 37 ° C, er proteiner re-brettet i sine aktive konformasjon og aktiviteten av ildfluen luciferase brukes som read-out: jo mer lys vil bli produsert, jo mer protein vil ha re-fått den opprinnelige eksteriør. Non-varme sjokkert celler er satt som referanse (100% av refoldedluciferase).

Watch this Scientific Journal Video about Intracellular Refolding Assay at JoVE.com

Intracellular Refolding Assay

I denne protokollen en metode for å måle intracellulært protein refolding etter varmesjokkproteiner er beskrevet. Denne metoden kan brukes til å studere foldases som molekylær anstand og deres co-faktorer eller forbindelser i stand til å påvirke deres aktivitet. Firefly luciferase aktivitet brukes som reporter for å måle anstand refolding aktivitet.

Intracellulære Refolding Assay

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

En metode for mus bukspyttkjertelens Isolering og Intracellulær cAMP Bestemmelse

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Sammen Analyser for Monitoring Protein Refolding i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intramikros for Imaging subcellulære strukturer i levende mus Uttrykke Fluorescent Proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Imaging Intracellulær Trafficking of APP med Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Påvisning av Intracellulær Gene Expression i levende celler av Muse, Human og svinekjøtt Origin med fluoresens-merket Nanopartikler

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

Rensing og Refolding til amyloidfibriler av (Hans)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged Rekombinant Shadoo Protein Uttrykt som inklusjonslegemer i<em&gt; E. coli</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Identifikasjon av intracellulære signal Hendelser indusert i levende celler ved Interaksjon med nabocellene gjennomgår celledød ved apoptose

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Optisk kvantifisering av intracellulær pH i Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia med fluorescerende genetisk kodet pH indikator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Objektivet-gratis Video mikroskopi for dynamisk og kvantitativ analyse av tilhenger cellekultur

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...