Name: intracellular refolding assay
Uploaded: 2012-01-24T13:00:00
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Danilo Maddalo é beneficiário de uma bolsa de pesquisa no Grupo de Jovem Pesquisador (YIG) do Instituto de Tecnologia de Karlsruhe.

1. Semeadura das células <ol><li> Antes de começar, aqueça o meio de cultura, a PBS 1X e da tripsina em banho-maria a 37 ˚ C </li><li> Tome as células fora da incubadora e aspirar o médio. </li><li> Aplicar suavemente 5 mL de PBS 1X sobre as células de lavá-las. </li><li> Aspirar o PBS 1X e aplicar 1 mL de tripsina contendo 0,025% EDTA. </li><li> Gire gentilmente a placa para ter uma distribuição uniforme da tripsina. </li><li> Coloque as células na incubadora a 37 ˚ C por 5-10 minutos (dependendo do tipo ...

<ol>
	<li>Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+and+protein+quality+control.">Molecular chaperones and protein quality control.</a> Cell. 125, 443-443 (2006).</li><li>Ritossa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+heat+shock+response.">Discovery of the heat shock response.</a> Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).</li><li>Hendrick, J. P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperone+functions+of+heat-shock+proteins.">Molecular chaperone functions of heat-shock proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).</li><li>Fuqua, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+proteins+and+drug+resistance.">Heat shock proteins and drug resistance.</a> Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).</li><li>Guzhova, I., Margulis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperone+as+a+survival+factor+in+cell+pathology.">Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology.</a> Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).</li><li>Whitesell, L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90+and+the+chaperoning+of+cancer.">HSP90 and the chaperoning of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG:+mechanisms+of+antitumour+activity.">17-AAG: mechanisms of antitumour activity.</a> Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).</li><li>Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HSP70+for+cancer+therapy.">Targeting HSP70 for cancer therapy.</a> Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).</li><li>Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+provides+neuroprotection+by+reducing+oxidative+stress+and+HSP70+expression+during+chronic+cerebral+hypoperfusion+in+ovariectomized+rats.">Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats.</a> J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).</li><li>Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaK,+DnaJ+and+GrpE+form+a+cellular+chaperone+machinery+capable+of+repairing+heat-induced+protein+damage.">DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage.</a> EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).</li><li>Thulasiraman, V., Matts, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+geldanamycin+on+the+kinetics+of+chaperone-mediated+renaturation+of+firefly+luciferase+in+rabbit+reticulocyte+lysate.">Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate.</a> Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).</li><li>Howarth, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp40+molecules+that+target+to+the+ubiquitin-proteasome+system+decrease+inclusion+formation+in+models+of+polyglutamine+disease.">Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease.</a> Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).</li><li>Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bag1+functions+in+vivo+as+a+negative+regulator+of+Hsp70+chaperone+activity.">Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).</li></ol>

Neste trabalho um protocolo para medir a atividade refolding intracelular de chaperones moleculares é apresentado. O ensaio completo pode ser realizado em 3 a 4 dias como mostra a visão geral na fig. 1. A robustez ea linearidade do sinal de luz produzida pelo vaga-lume ea luciferase renilla representam uma base sólida para a reprodutibilidade do protocolo. A etapa crítica do ensaio é a escolha de um reagente de transfecção eficiente para g...

Para esta experiência &quot;Luz Vector &#39;a Luminômetro forma Perkin Elmer Contador Luminescência &#39;1420 foi usado Programas para o Luminômetro: Renilla: Bomba 1, 100 mL de injeção Tampão de reação: Pump1, 70 mL de injeção Luciferina: Pump2, a injeção de 30μl Para os buffers preparar estas soluções estoque em água destilada duas vezes: <ul style="list-style:none"><li> - 1M MgSO 4: 246,48 g MgSO 4 * 7H 2 O em 1 litro </li><li> - 0,5 M EGTA: 190,18 g EGTA em 1 litro </li><li> - 1M KH 2 PO 4: 136,09 g KH 2 PO 4 em 1 litro </li><li> - 1M K2 HPO 4: 228,23 g K 2 HPO 4 * 3H 2 O em 1 litro </li><li> - NaCl 5M: 292,2 g de NaCl em 1 litro </li><li> - 0,5 M EDTA: 186,12 g EDTA * 2H 2 O em 1 litro &nbsp;</li></ul> GLI-GLI-buffer: <ul style="list-style:none"><li> - 25mM Glycylglycin </li><li> - 15mm MgSO 4 </li><li> - 4 mM EGTA </li></ul> Para 1 litro use 3,3 g de Glycylglycin, 15ml de uma solução de MgSO4 1M e 8ml de uma solução 0,5 M EGTA. Resolver em água, ajustar o pH para 7,8 e trazer para um volume total de 1 litro. Tampão de reação para Renilla / celenterazina buffer: <ul style="list-style:none"><li> - &amp; Nbsp; 13,4 mM KH 2 PO 4 </li><li> - 86,6 mM KH 2 PO 4 </li><li> - 0,5 M NaCl </li><li> - 1mM EDTA </li></ul> Para 1 litro ml usar 13,4 de um 1M KH 2 PO 4 solução, 86,6 ml de uma 1M K 2 HPO 4 solução, 100ml de uma solução de NaCl 5M e 2ml de uma solução de EDTA 0,5 M. <table border="1"><tr><td></td><td> Companhia </td><td> Catálogo / Produto Número: </td></tr><tr><td> DMEM (Dulbecco Modificado Eagle Medium 1X) </td><td> GIBCO </td><td> 41966029 </td></tr><tr><td> Ouro de soro fetal bovino </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td></tr><tr><td> X-treme Gene 9 Reagente Transfection DNA </td><td> Roche </td><td&gt; 06365809001 </td></tr><tr><td> PBS Phosphate Buffered Saline Dulbecco 1X </td><td> GIBCO </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> MOPS 3 - (N-Morfolino) Propanesulfonic ácido </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Cicloheximida </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> C7698 </td></tr><tr><td> Tampão de Lise passiva 5X </td><td> Promega </td><td> E194A </td></tr><tr><td> Glycylglycin EGTA MgSO 4 (MgSO 4 * 7H 2 O) </td><td> SIGMA-ALDRICH Roth Roth </td><td> G7278 3054,2 P027.1 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 (K 2 HPO 4 * 3H 2 O) NaCl EDTA </td><td> Roth Roth Roth Roth </td><td> 3904,1 6878,2 3957,1 8043,1 </td></tr><tr><td> Luciferina Firefly </td><td> Biosynth </td><td> L8200 </td></tr><tr><td> Celenterazina </td><td> Biosynth </td><td> C7000 </td></tr><tr><td> DTT (Ditiotreitol) </td><td> Roth </td><td> 6908,2 </td></tr><tr><td> ATP (adenosina trifosfato) </td><td> Roche </td><td> 10519987001 </td></tr></table>

intracellular refolding assay

Este protocolo descreve um método para medir a atividade enzimática de chaperones moleculares em um sistema baseado em células e os possíveis efeitos de compostos com atividade inibitória / estimulante. Chaperones moleculares são proteínas envolvidas na regulação do enovelamento de proteínas 1 e têm um papel crucial na promoção da sobrevivência celular após insultos estresse, como choque térmico 2, a fome de nutrientes e exposição a produtos químicos / venenos 3. Por esta razão chaperones são encontrados para ser envolvido em eventos como o desenvolvimento do tumor, chemioresistance das células cancerosas 4, bem como neurodegeneração 5. Desenho de pequenas moléculas capazes de inibir ou estimular a atividade destas enzimas é, portanto, uma das estratégias mais estudadas para terapia de câncer e doenças neurodegenerativas 7 9. O ensaio aqui descrito oferece a possibilidade de medir a atividade refolding de um chaperone molecular particular e para estudar o efeito da compounds sobre a sua actividade. Neste método o gene da chaperone molecular investigado é transfectadas com uma codificação de vetor de expressão para o gene luciferase vaga-lumes. Já foi descrito que a luciferase firefly desnaturado podem ser reabertos por chaperones moleculares 10,11. Como normalizar o controle de transfecção, uma codificação de vetor para o gene luciferase é renilla transfectadas. Todos os transfections descritos neste protocolo são realizadas com X-treme Gene 11 (Roche) em células HEK-293. Na primeira etapa, a síntese protéica é inibida pelo tratamento das células com cicloheximida. Posteriormente proteína desdobramento é induzida por choque térmico a 45 ° C por 30 minutos. Após a recuperação, a 37 ° C, as proteínas são re-dobrada em sua conformação ativa e da atividade da luciferase firefly é usado como ler-out: quanto mais luz será produzido, o mais proteína terá re-ganhou a conformação original. Não-calor células chocado são definidos como referência (100% de refoldedluciferase).

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Intracellular Refolding Assay

Neste protocolo um método para medir refolding proteína intracelular após choque térmico é descrito. Este método pode ser usado para estudar foldases como chaperonas moleculares e seus co-fatores ou compostos capazes de influenciar a sua actividade. Firefly luciferase atividade é utilizado como repórter para medir a atividade refolding acompanhante.

Ensaio redobrando intracelular

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Research

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Biology

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