Name: intracellular refolding assay
Uploaded: 2012-01-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intracellular Refolding Assay at JoVE.com

Данило Maddalo является получателем исследования общения как группа молодых следователя (ЖИГ) из Карлсруэ технологический институт.

1. Посев клетки <ol><li> Перед началом разминки культуральной среде, PBS 1X и трипсина в водяной бане при температуре 37 ˚ C </li><li> Возьмите клеток из инкубатора и аспирата среды. </li><li> Осторожно применять 5 мл ФСБ 1X на клетки, чтобы вымыть их. </li><li> Аспирируйте PBS 1X и закапывать по 1 мл трипсина соде...

<ol>
	<li>Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+and+protein+quality+control.">Molecular chaperones and protein quality control.</a> Cell. 125, 443-443 (2006).</li><li>Ritossa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+heat+shock+response.">Discovery of the heat shock response.</a> Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).</li><li>Hendrick, J. P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperone+functions+of+heat-shock+proteins.">Molecular chaperone functions of heat-shock proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).</li><li>Fuqua, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+proteins+and+drug+resistance.">Heat shock proteins and drug resistance.</a> Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).</li><li>Guzhova, I., Margulis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperone+as+a+survival+factor+in+cell+pathology.">Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology.</a> Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).</li><li>Whitesell, L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90+and+the+chaperoning+of+cancer.">HSP90 and the chaperoning of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG:+mechanisms+of+antitumour+activity.">17-AAG: mechanisms of antitumour activity.</a> Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).</li><li>Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HSP70+for+cancer+therapy.">Targeting HSP70 for cancer therapy.</a> Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).</li><li>Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+provides+neuroprotection+by+reducing+oxidative+stress+and+HSP70+expression+during+chronic+cerebral+hypoperfusion+in+ovariectomized+rats.">Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats.</a> J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).</li><li>Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaK,+DnaJ+and+GrpE+form+a+cellular+chaperone+machinery+capable+of+repairing+heat-induced+protein+damage.">DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage.</a> EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).</li><li>Thulasiraman, V., Matts, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+geldanamycin+on+the+kinetics+of+chaperone-mediated+renaturation+of+firefly+luciferase+in+rabbit+reticulocyte+lysate.">Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate.</a> Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).</li><li>Howarth, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp40+molecules+that+target+to+the+ubiquitin-proteasome+system+decrease+inclusion+formation+in+models+of+polyglutamine+disease.">Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease.</a> Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).</li><li>Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bag1+functions+in+vivo+as+a+negative+regulator+of+Hsp70+chaperone+activity.">Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).</li></ol>

В этой работе протокол для измерения активности внутриклеточных рефолдинг молекулярных шаперонов представлена. Весь анализ может быть выполнен в 3-х до 4 дней, как показано на рис обзор. 1. Надежность и линейность световой сигнал, и светлячка renilla люциферазы пред...

Для этого эксперимента &#39;Векторные Light&#39; люминометр форме Перкин Элмер &#39;1420 Люминесценция счетчика была использована Программы для люминометр: Renilla: Насос 1, 100 мкл инъекции Реакция буфера: Pump1, 70 мкл инъекции Люциферин: Pump2, 30μl инъекции Для буферов подготовить эти растворы в бидистиллированной воде: <ul style="list-style:none"><li> - 1M MgSO 4: 246,48 г MgSO 4 * 7H 2 O в 1 л </li><li> - 0,5 M EGTA: 190,18 г EGTA в 1 л </li><li> - 1M KH 2 PO 4: 136,09 г KH 2 PO 4 в 1 л </li><li> - 1M K2 HPO 4: 228,23 г K 2 HPO 4 * 3H 2 O в 1 л </li><li> - 5М NaCl: 292,2 г NaCl в 1 л </li><li> - 0,5 М ЭДТА: 186,12 г ЭДТА * 2H 2 O в 1 л &nbsp;</li></ul> Gly-Gly-буфера: <ul style="list-style:none"><li> - 25мм Glycylglycin </li><li> - 15мм MgSO 4 </li><li> - 4 мм EGTA </li></ul> За 1 литр использовать 3,3 г Glycylglycin, 15 мл 1М MgSO4 решение и 8 мл из 0,5 М раствора EGTA. Решите в воду, регулировать рН до 7,8 и доводят до общего объема 1 л. Реакция буфер для Renilla / Coelenterazine буфера: <ul style="list-style:none"><li> - &amp; NBП., 13,4 мМ KH 2 PO 4 </li><li> - 86,6 мМ KH 2 PO 4 </li><li> - 0,5 М NaCl </li><li> - 1мм ЭДТА </li></ul> За 1 литр использовать 13,4 мл 1М KH 2 PO 4 решения, 86,6 мл 1М K 2 HPO 4 раствор, 100 мл 5М раствор NaCl и 2 мл 0,5 М раствора ЭДТА. <table border="1"><tr><td></td><td> Компания </td><td> Каталог / Номер продукта: </td></tr><tr><td> DMEM (Дульбеко изменения Eagle Средний 1X) </td><td> GIBCO </td><td> 41966029 </td></tr><tr><td> Эмбриональной бычьей сыворотки золото </td><td> ПАА </td><td> А15-151 </td></tr><tr><td> X-Treme Ген 9 Реагент ДНК Трансфекция </td><td> Roche </td><td&gt; 06365809001 </td></tr><tr><td> PBS Фосфаты Дульбеко буферном растворе 1X </td><td> GIBCO </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> MOPS 3 - (N-морфолино) пропансульфоновой кислоты </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Циклогексимид </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7698 </td></tr><tr><td> Пассивный буфера Лизис 5X </td><td> Promega </td><td> E194A </td></tr><tr><td> Glycylglycin EGTA MgSO 4 (MgSO 4 * 7H 2 O) </td><td> Sigma-Aldrich Рот Рот </td><td> G7278 3054,2 P027.1 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 (K 2 HPO 4 * 3H 2 O) NaCl ЭДТА </td><td> Рот Рот Рот Рот </td><td> 3904,1 6878,2 3957,1 8043,1 </td></tr><tr><td> Люциферин Firefly </td><td> Biosynth </td><td> L8200 </td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Biosynth </td><td> C7000 </td></tr><tr><td> DTT (дитиотреитол) </td><td> Рот </td><td> 6908,2 </td></tr><tr><td> АТФ (аденозинтрифосфорной кислоты) </td><td> Roche </td><td> 10519987001 </td></tr></table>

intracellular refolding assay

Этот протокол описывает метод для измерения ферментативной активности молекулярных шаперонов в клеточной системе и возможные последствия соединений с тормозным / стимулирующей деятельности. Молекулярная шаперонов являются белки, участвующие в регуляции сворачивания белка 1 и играют решающую роль в обеспечении выживаемости клеток на стресс оскорбления, как тепловой шок 2, питательных голода и воздействия химических веществ / яды 3. По этой причине шаперонов оказываются вовлечены в события, как развитие опухоли, chemioresistance раковых клеток 4, а также нейродегенеративные 5. Дизайн малых молекул способен подавлять или стимулировать активность этих ферментов является одной из наиболее изученных стратегий для лечения рака 7 и нейродегенеративные расстройства 9. Анализ описанных здесь предлагает возможность измерения рефолдинг деятельности частности молекулярный шаперон и изучение влияния компounds о своей деятельности. В этом методе ген молекулярных шаперонов исследуемый трансфицированных вместе с кодировкой вектор экспрессии для генов люциферазы светлячка. Это уже описано, что денатурированный люциферазы светлячка можно сложил на молекулярных шаперонов 10,11. Как нормализации трансфекции контроля, вектор кодировки для renilla люциферазы гена трансфекции. Все трансфекции, описанные в этом протоколе выполнены с X-Treme Ген 11 (Roche) в НЕК-293 клеток. На первом этапе, синтез белка подавляется обработки клеток циклогексимид. После разворачивания белка индуцирована теплового шока при 45 ° С в течение 30 минут. После восстановления при 37 ° C, белки заново сложить в их активную конформацию и активность люциферазы светлячка используется в качестве считывания: больше света будет произведено, тем больше белка будет повторно приобрел оригинальную конформацию. Номера для тепла шокированы клетки устанавливаются в качестве справочных (100% сложиллюциферазы).

Watch this Scientific Journal Video about Intracellular Refolding Assay at JoVE.com

Intracellular Refolding Assay

В этом протоколе метод измерения внутриклеточного белка рефолдинг после теплового шока описан. Этот метод может быть использован для изучения foldases как молекулярных шаперонов и их ко-факторы или соединений, способных влиять на их деятельность. Firefly активности люциферазы используется в качестве репортера для измерения активности шаперона рефолдинг.

Внутриклеточное Пробирной рефолдинг

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Измерение Ближнего плазматической мембраны и глобальной динамики внутриклеточного кальция в астроциты

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Метод мышь панкреатических островков изоляции и внутриклеточного цАМФ определения

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

В сочетании Анализы для мониторинга рефолдинг Белок в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Прижизненные микроскопия для визуализации субклеточных структур в живых мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Воображение внутриклеточных торговли АРР с Фотоактивируемые GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Обнаружение внутриклеточных экспрессии генов в живых клетках мышиных, человеческого и свиного происхождения с помощью флуоресцентной меченных наночастиц

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

Очистка и повторной укладки в амилоидных фибрилл в (Его)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged рекомбинантный белок Shadoo Выраженный в виде телец включения в<em&gt; Кишечная палочка</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Идентификация внутриклеточных сигнальных событий, наведенных в жизнеспособные клетки при взаимодействии с соседними сотами Проходят апоптотической гибели клеток

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Оптических количественная оценка внутриклеточный pH в Drosophila melanogaster Malpighian трубочку эпителия с флуоресцентные генетически закодированный pH индикатор

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Объектив Бесплатные видео микроскопии для динамического и количественный анализ культуры адэрентных клеток

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...