Name: intracellular refolding assay
Uploaded: 2012-01-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intracellular Refolding Assay at JoVE.com

Danilo Maddalo bir araştırma bursu, Karlsruhe Teknoloji Enstitüsü Genç Araştırmacı Grubu (YIG) olarak bir alıcı.

1. Hücreleri Seeding <ol><li> Başlamadan önce, 37 az bir su banyosu içinde, kültür ortamı, PBS 1X ve tripsin ısınmak ˚ C </li><li> Kuluçka hücrelerini alın ve orta aspire. </li><li> 5 ml PBS 1X nazikçe yıkayın hücreleri geçerlidir. </li><li> PBS 1X aspire tripsin EDTA% 0,025 içeren 1 ml uygulayın. </li><li> Tripsin eşit bir dağılıma sahip olduğu plaka hafifçe döndürün. </li><li> 37 inkübatör hücrelerin yerleştirin ˚ C (hücre tipine bağlı olarak 5-10 dakika). Zaman zaman kontrol hü...

<ol>
	<li>Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+and+protein+quality+control.">Molecular chaperones and protein quality control.</a> Cell. 125, 443-443 (2006).</li><li>Ritossa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+heat+shock+response.">Discovery of the heat shock response.</a> Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).</li><li>Hendrick, J. P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperone+functions+of+heat-shock+proteins.">Molecular chaperone functions of heat-shock proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).</li><li>Fuqua, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+proteins+and+drug+resistance.">Heat shock proteins and drug resistance.</a> Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).</li><li>Guzhova, I., Margulis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperone+as+a+survival+factor+in+cell+pathology.">Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology.</a> Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).</li><li>Whitesell, L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90+and+the+chaperoning+of+cancer.">HSP90 and the chaperoning of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG:+mechanisms+of+antitumour+activity.">17-AAG: mechanisms of antitumour activity.</a> Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).</li><li>Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HSP70+for+cancer+therapy.">Targeting HSP70 for cancer therapy.</a> Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).</li><li>Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+provides+neuroprotection+by+reducing+oxidative+stress+and+HSP70+expression+during+chronic+cerebral+hypoperfusion+in+ovariectomized+rats.">Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats.</a> J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).</li><li>Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaK,+DnaJ+and+GrpE+form+a+cellular+chaperone+machinery+capable+of+repairing+heat-induced+protein+damage.">DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage.</a> EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).</li><li>Thulasiraman, V., Matts, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+geldanamycin+on+the+kinetics+of+chaperone-mediated+renaturation+of+firefly+luciferase+in+rabbit+reticulocyte+lysate.">Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate.</a> Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).</li><li>Howarth, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp40+molecules+that+target+to+the+ubiquitin-proteasome+system+decrease+inclusion+formation+in+models+of+polyglutamine+disease.">Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease.</a> Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).</li><li>Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bag1+functions+in+vivo+as+a+negative+regulator+of+Hsp70+chaperone+activity.">Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).</li></ol>

Bu çalışmada, moleküler şaperonlar içi refolding aktivitesini ölçmek için bir protokol sunulmuştur. Şekil bakış gösterildiği gibi tüm testi 3 ila 4 gün içinde yapılabilir. 1. Ateş böceği ve renilla lusiferaz tarafından üretilen ışık sinyali sağlamlık ve doğrusallık, tekrarlanabilirlik protokol için sağlam bir temel temsil eder. Testin kritik adım, moleküler hastabakıcı ve ateşböceği lusifer...

Bu deneme için bir Luminometre formu Perkin Elmer &#39;1420 Lüminesans Sayaç &#39;Vektör Light&#39; kullanıldı Luminometre Programları: Renilla: Pompa 1, 100 ul enjeksiyon Reaksiyon Tamponu: Pump1, 70 ul enjeksiyon Luciferase: Pump2, 30μl enjeksiyon Tamponlar çift distile su bu stok solüsyonları hazırlamak için: <ul style="list-style:none"><li> 1M MgSO 4: 1 litre 246,48 g MgSO 4 * 7H 2 O </li><li> - 0,5 M EGTA: 1 litre 190,18 g EGTA </li><li> - 1M KH 2 PO 4: 1 litre 136,09 g KH 2 PO 4 </li><li> - 1M K2 HPO 4: 228,23 g K 2 HPO 4 * 1 litre 3H 2 O </li><li> - 5M NaCl: 1 litre 292,2 g NaCl </li><li> - 0,5 M EDTA: 1 litre 186,12 g EDTA * 2H 2 O &nbsp;</li></ul> Gly-Gly-tampon: <ul style="list-style:none"><li> - 25mm Glycylglycin </li><li> - 15mm MgSO 4 </li><li> - 4mm EGTA </li></ul> Için 1 litre Glycylglycin kullanımı 3,3 g, 1M MgSO4 çözüm ve 0,5 M EGTA çözüm, 8 ml 15ml. Su içinde çözün, 7,8 pH ayarlamak ve toplam hacim 1 litre getirmek. Renilla / Coelenterazine tampon reaksiyon tamponu: <ul style="list-style:none"><li> &amp; Nbsp; 13,4 mM KH 2 PO 4 </li><li> KH 2 PO 4 - 86,6 mM </li><li> - 0,5 M NaCl </li><li> - 1mm EDTA </li></ul> 1 litre 1M KH 2 PO 4 çözümü kullanmak 13,4 ml, 86,6 ml, 5M NaCl çözeltisi ve 2 ml 0,5 M EDTA çözeltisi 100ml 1M bir K 2 HPO 4 çözüm . <table border="1"><tr><td></td><td> Şirket </td><td> Katalog / Ürün Numarası: </td></tr><tr><td> DMEM (Dulbecco&#39;nun Modifiye Eagle Orta 1X) </td><td> Gibco </td><td> 41966029 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum Altın </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td></tr><tr><td> X-treme Gen 9 DNA Transfeksiyon Reaktif </td><td> Roche </td><td&gt; 06365809001 </td></tr><tr><td> PBS Dulbecco&#39;nun Fosfat Tuzlu 1X Tamponlu </td><td> Gibco </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> MOPS 3 - (N-morfolino) propan sülfonik asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7698 </td></tr><tr><td> Pasif Lizis Tampon 5X </td><td> Promega </td><td> E194A </td></tr><tr><td> Glycylglycin EGTA MgSO 4 (MgSO 4 * 2 O 7H) </td><td> Sigma-Aldrich Roth Roth </td><td> G7278 3054,2 P027.1 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 (K 2 HPO 4 * 3H 2 O) NaCl EDTA </td><td> Roth Roth Roth Roth </td><td> 3904,1 6878,2 3957,1 8043,1 </td></tr><tr><td> Luciferase Firefly </td><td> Biosynth </td><td> L8200 </td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Biosynth </td><td> C7000 </td></tr><tr><td> DTT (dithiothreitol) </td><td> Roth </td><td> 6908,2 </td></tr><tr><td> ATP (adenozin trifosfat) </td><td> Roche </td><td> 10519987001 </td></tr></table>

intracellular refolding assay

Bu protokol, bir hücre tabanlı bir sistem ve inhibitör / uyarıcı aktiviteye sahip bileşikler olası etkileri içinde moleküler şaperonlar enzimatik aktivitesini ölçmek için bir yöntem açıklanır. Moleküler şaperonlar 1 katlama protein yönetmelikte yer alan proteinler ve ısı şok 2, besin açlık ve kimyasallar / zehirler 3 maruz kalma gibi stres hakaretler üzerine hücre sağkalım teşvik çok önemli bir rol var. Bu nedenle şaperonlar tümör gelişimi, kanser hücreleri 4 chemioresistance yanı sıra nörodejenerasyon 5 gibi etkinliklere yer bulunur. Bu nedenle, bu enzimlerin aktivitesini inhibe veya teşvik etmek için küçük moleküllerin tasarımı, kanser tedavisi 7 ve nörodejeneratif hastalıkların 9 için en çok çalışılan stratejileri biridir. Burada açıklanan belirli bir moleküler şaperon refolding aktivitesini ölçmek ve comp etkisini araştırmak için tahlil imkanı sunarfaaliyet ounds. Bu yöntemde, incelenen moleküler şaperon gen ateşböceği lusiferaz gen ekspresyon vektörü kodlama ile birlikte transfekte. Zaten denatüre ateşböceği lusiferaz moleküler şaperonlar 10,11 refolded olabileceği tarif edilmiştir. Transfeksiyon kontrolü normalleştirilmesi gibi, renilla lusiferaz gen için bir vektör kodlama transfekte. Bu protokolü açıklanan tüm transfections HEK-293 hücrelerinde X-treme Gen 11 (Roche) ile yapılmaktadır. İlk adımda, protein sentezi, Siklohekzimidsiz hücrelerin tedavi inhibe edilir. Bundan sonra açığa çıkmasını protein 30 dakika boyunca 45 ° C&#39;de ısı şok indüklenir. 37 ° kurtarma üzerine ° C, proteinler yeniden katlanmış ve onların aktif konformasyon ateşböceği lusiferaz faaliyet okuma olarak kullanılır: daha fazla ışık olacak, daha fazla protein orijinal konformasyon yeniden kazanmış olacaktır. Isıl şok hücreleri referans (refolded,% 100 olarak belirlenmiştirlusiferaz).

Watch this Scientific Journal Video about Intracellular Refolding Assay at JoVE.com

Intracellular Refolding Assay

Bu protokol ısı şok sonra hücre içi protein refolding ölçmek için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, faaliyetlerini etkilemek için moleküler şaperonlar ve bunların eş-faktörleri veya bileşikleri gibi foldases incelemek için kullanılabilir. Firefly lusiferaz aktivitesini muhabir olarak hastabakıcı refolding aktivitesini ölçmek için kullanılır.

Hücre içi Refolding Testi

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Astrositler Plazma Membran ve Küresel Hücre içi kalsiyum Dynamics civarında Ölçüm

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Photoactivatable GFP ile APP Hücre içi Ticareti Görüntüleme

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Floresan etiketli Nanopartiküller kullanma Fare, İnsan ve domuz Menşe Canlı hücreler hücre içi Gen İfade Algılama

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

Saflaştırma ve Amiloid fibrillerin kadar yeniden katlama (His)<sub&gt; 6</sub&gt; etiketli Rekombinant Shadoo Protein Eklenmesi Organları olarak ifade<em&gt; E.coli</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Hücre içi Komşu maruz kalan hücreler, apoptotik hücre ölümü ile etkileşim yoluyla canlı hücreler İndüklenen sinyal olaylarının tanımlanması

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Drosophila melanogaster Malpighi tübül epiteli optik Quantification intrasellüler pH floresan genetik olarak kodlanmış pH göstergesi

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Dinamik için objektif-ücretsiz Video mikroskobu ve kantitatif analiz yapisan hücre kültürü

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...