Name: inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons
Uploaded: 2012-03-21T12:00:00
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Diese Arbeit wurde aus Mitteln des National Institutes of Health (Zuschüsse R21 R01 und NS45037 ES014901) unterstützt.

1. Vorbereitung von Kulturmedium (C2-Medium) <ol><li> Fügen Sie den folgenden, in der Reihenfolge aufgeführt, zu einer sterilen Einweg 500 ml Erlenmeyerkolben: <table border="1"><tbody><tr><td> Betrag </td><td> Komponente </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> 190 ml </td><td> DMEM (low Glukose) </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> fettsäurefrei BSA (20mg/ml in DMEM) </td><td> 50 ug / ml </td></tr><tr><td> 2,8 ml </td><td> L-Glutamin </td><td> ...

<ol>
	<li>Purpura, D. P., Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Neurosciences: A Study Program. , 372-393 (1967).</li><li>Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+changes+in+mammalian+sympathetic+neurons+following+interruption+of+their+axons.">Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons.</a> J. Physiol. 252, 429-463 (1975).</li><li>Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Trophic Theory of Neural Connections. , (1988).</li><li>Miller, J. P., Jacobs, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+neuronal+structure+and+function.">Relationships between neuronal structure and function.</a> J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).</li><li>Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+specificity+and+long-term+information+storage.">Synapse specificity and long-term information storage.</a> Neuron. 18, 339-342 (1997).</li><li>Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+year+of+the+dendrite.">The year of the dendrite.</a> Science. 275, 178-179 (1997).</li><li>Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+and+dendritic+analysis+of+fascia+dentata+granule+cells+in+human+aging+and+senile+dementia.">Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia.</a> Brain Res. 402, 217-229 (1987).</li><li>Flood, D. G., Coleman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+plasticity+in+normal+aging+and+decreased+plasticity+in+Alzheimer's+disease.">Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer's disease.</a> Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).</li><li>Jagadha, V., Becker, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+pathology:+an+overview+of+Golgi+studies+in+man.">Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man.</a> Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).</li><li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.+I.+Conditions+under+which+neurons+form+axons+but+not+dendrites.">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites.</a> Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).</li><li>Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+promote+dendritic+development+in+rat+sympathetic+neurons+in+vitro.">Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro.</a> Glia. 1, 380-392 (1988).</li><li>Lein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+extracellular+matrix+and+osteogenic+protein-1+on+the+morphological+differentiation+of+rat+sympathetic+neurons.">The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).</li><li>Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+induces+dendritic+growth+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons.</a> Neuron. 15, 597-605 (1995).</li><li>Lein, P. J., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+and+a+basement+membrane+extract+have+different+effects+on+axonal+and+dendritic+outgrowth+from+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+vitro.">Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro.</a> 136, 330-345 (1989).</li><li>Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 177-295 (1991).</li><li>Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-5+(BMP-5)+promotes+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons.">Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).</li><li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).</li><li>Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+induce+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons+by+modulating+the+balance+between+bone+morphogenetic+proteins+(BMPs)+and+BMP+antagonists.">Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists.</a> J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).</li><li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).</li><li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.+II.+Serum+promotes+dendritic+growth.">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth.</a> Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).</li></ol>

Die Vorteile dieses Modells sind: (a) werden die Kulturen einer homogenen Population von sympathischen Neuronen frei von anderen Zelltypen 17,23 umfasst, (b) die Anforderungen der Wachstumsfaktor sympathischen Neuronen sind gut etabliert, das erlaubt die Verwendung von definiertes Medium, und eine Vielzahl von definierten Medien und Substrate eignen sich gut für das Wachstum und die Aufrechterhaltung sympathischen Neuronen 23; (c) Neuronen in diesen Kulturen gleichmäßig Reaktion auf die Dendrite...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Bellco </td><td> 1943-10012 </td><td> Rund 12 mm Deckglas Nr. 1 Dicke, Deutsch Glas </td></tr><tr><td> Bent Tip Pipetten </td><td> Bellco </td><td> 1273-50003 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lysin </td><td> Sigma </td><td> P0899-100MG </td><td> Stammlösung 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Destilliertes Wasser </td><td> Gibco </td><td> 15230 </td><td></td></tr><tr><td> Feinen Pinzette Dumont-Nr. 4 und 5 </td><td> Fine Science Tools (FST) </td><td> 11252-30 11241-30 </td><td></td></tr><tr><td> 20-Gauge-Nadeln </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz L-15-Medium </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Worthington </td><td> 4176 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td> Hanks ausgewogener Salzlösung (-Ca,-Mg) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM Low Glucose </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Insulin / Transferrin / Selen </td><td> Invitrogen </td><td> 51500-056 </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Fettsäure-freies BSA </td><td> Calbiochem </td><td> 126609 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> Harlan Bioproducts </td><td> 5017 </td><td></td></tr><tr><td> Ham F-12 Nährmedium (F-12) </td><td> Invitrogen </td><td> 11765 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Cytosinarabinosid </td><td> Sigma </td><td> C1768 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356234 </td><td> Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen </td></tr><tr><td> BMP-7 </td><td> R &amp; D Systems Curis, Inc. </td><td> 345-BP-07H BMP7 </td><td> BMPs 4, 5 und 6 funktionieren ebenso gut wie BMP-7 und sind manchmal einfacher, kommerziell erhalten </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fischer </td><td> BP151-500 </td><td></td></tr><tr><td> Maus anti-Ratte-Antikörper MAP2 </td><td> Sternberg Monoclonals Inc. </td><td> SMI52 </td><td> 1/5000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 Ziege-anti-Maus </td><td> Invitrogen </td><td> A11003 </td><td> 1/10000 </td></tr><tr><td> Eindeckmittel </td><td> Verlängern Sie Antifade Kit Molecular Probes </td> &lt;td&gt; P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons

Die Form der dendritischen Dorn bestimmt die gesamte synaptischen Eingang ein Neuron erhält 1-3 können, und beeinflusst die Art und Verteilung dieser Eingänge 4-6. Veränderte Muster des dendritischen Wachstums und Plastizität sind mit beeinträchtigter Funktion neurobehavioral in experimentellen Modellen 7 zugeordnet und werden gedacht, um zu klinischen Symptomen in beiden neurologische Entwicklungsstörungen 8-10 und 11-13 neurodegenerativen Erkrankungen beobachtet beitragen. Solche Beobachtungen unterstreichen die funktionelle Bedeutung der exakt regulieren dendritische Morphologie, und legen nahe, dass Identifizierung von Mechanismen, dendritische Wachstum steuern nicht nur das Verständnis für, wie neuronale Konnektivität wird während der normalen Entwicklung geregelt, kann aber auch einen Einblick auf neue therapeutische Strategien für die verschiedensten neurologischen Erkrankungen. Mechanistische Untersuchungen von dendritischen Wachstum würde durch die Verfügbarkeit o erleichtert werdenfa-Modell, das Neuronen experimentell aus einem Zustand, in dem sie nicht zu einer Verlängerung Dendriten auf, in dem sie einen dendritischen Dorn vergleichbar mit der von ihren Pendants in vivo erarbeiten geschaltet werden können. Primäre Kulturen von sympathischen Neuronen losgelöst von der überlegenen zervikalen Ganglien (SCG) der perinatalen Nager bieten ein solches Modell. Wenn in einem definierten Medium in Abwesenheit von Serum-und Ganglien-Glia-Zellen kultiviert werden, zu erweitern sympathischen Neuronen einen einzigen Vorgang, der axonalen ist, und dieser Zustand hält für unipolare Wochen bis Monate in Kultur 14,15. Jedoch löst die Zugabe von entweder Knochenmorphogenetischem Protein-7 (BMP-7) oder 16,17 Matrigel 18 mit dem Kulturmedium diese Neuronen, mehrere Prozesse, die die morphologische, biochemische und funktionelle Kriterien für Dendriten erstrecken. Sympathischen Neuronen losgelöst von der SCG der perinatalen Nagetiere und unter definierten Bedingungen gewachsen sind eine homogene Population von Neuronen 19, die gleichmäßig auf die Dendriten-Aktivität von Matrigel, BMP-7 und anderen BMPs der decapentaplegisch (dpp) und 60A Unterfamilien 17,18,20,21 reagieren. Wichtig ist, tritt Matrigel-und BMP-induzierte Dendritbildung in der Abwesenheit von Änderungen der das Überleben der Zelle oder axonalen Wachstums 17,18. Hier beschreiben wir, wie Sie dissoziierten Kulturen sympathischer Neurone aus dem SCG der perinatalen Ratten abgeleitet, so dass sie in Reaktion auf die selektive Dendriten-Aktivität von Matrigel oder BMPs sind.

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Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Wir beschreiben ein Protokoll für die Verwendung Knochenmorphogenetischem Protein-7 (BMP-7) oder Matrigel, um selektiv zu induzieren dendritisches Wachstum in Original-sympathischen Neuronen dissoziiert von der oberen Halsganglien (SCG) der perinatalen Ratten.

Induktion von dendritischen Wachstums in Cultured sympathischen Neuronen

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Forschung

Neurowissenschaften

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Imaging Receptor Insertion in die Plasmamembran pHluorin-Tag in der Grundschule Cultured Mäuseneuronen

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...