Name: inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons
Uploaded: 2012-03-21T12:00:00
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Este trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Nacionales de Salud (subvenciones R21 NS45037 y ES014901 R01).

1. Preparación del medio de cultivo (medio C2) <ol><li> Añadir el siguiente, en el orden indicado, a una estéril, desechable matraz Erlenmeyer de 500 ml: <table border="1"><tbody><tr><td> Cantidad </td><td> Componente </td><td> La concentración final </td></tr><tr><td> 190 ml </td><td> DMEM (glucosa baja) </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> de ácidos grasos libres de BSA (20mg/ml en DMEM) </td><td> 50 g / ml </td></tr><tr><td> 2,8 ml </td><td> L-gl...

<ol>
	<li>Purpura, D. P., Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Neurosciences: A Study Program. , 372-393 (1967).</li><li>Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+changes+in+mammalian+sympathetic+neurons+following+interruption+of+their+axons.">Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons.</a> J. Physiol. 252, 429-463 (1975).</li><li>Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Trophic Theory of Neural Connections. , (1988).</li><li>Miller, J. P., Jacobs, G. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+and+dendritic+analysis+of+fascia+dentata+granule+cells+in+human+aging+and+senile+dementia.">Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia.</a> Brain Res. 402, 217-229 (1987).</li><li>Flood, D. G., Coleman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+plasticity+in+normal+aging+and+decreased+plasticity+in+Alzheimer's+disease.">Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer's disease.</a> Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).</li><li>Jagadha, V., Becker, L. 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I., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+promote+dendritic+development+in+rat+sympathetic+neurons+in+vitro.">Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro.</a> Glia. 1, 380-392 (1988).</li><li>Lein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+extracellular+matrix+and+osteogenic+protein-1+on+the+morphological+differentiation+of+rat+sympathetic+neurons.">The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).</li><li>Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+induces+dendritic+growth+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons.</a> Neuron. 15, 597-605 (1995).</li><li>Lein, P. J., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+and+a+basement+membrane+extract+have+different+effects+on+axonal+and+dendritic+outgrowth+from+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+vitro.">Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro.</a> 136, 330-345 (1989).</li><li>Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 177-295 (1991).</li><li>Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-5+(BMP-5)+promotes+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons.">Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).</li><li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons.">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).</li><li>Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+induce+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons+by+modulating+the+balance+between+bone+morphogenetic+proteins+(BMPs)+and+BMP+antagonists.">Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists.</a> J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).</li><li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 177-205 (1991).</li><li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.+II.+Serum+promotes+dendritic+growth.">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth.</a> Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).</li></ol>

Las ventajas de este modelo incluyen: (a) los cultivos se compone de una población homogénea de las neuronas simpáticas desprovistos de otros tipos de células 17,23; (b) los requisitos del factor de crecimiento de las neuronas simpáticas son bien establecido, que permite el uso de un medio definido, y una variedad de medios definidos, y sustratos funcionan bien para el cultivo y el mantenimiento de las neuronas simpáticas 23, (c) las neuronas en estos cultivos responder de manera uniforme a l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Cubreobjetos de vidrio </td><td> Bellco </td><td> 1943-10012 </td><td> 12 mm Cubreobjetos Ronda n º 1 de espesor, vidrio alemán </td></tr><tr><td> Bent punta de pipetas </td><td> Bellco </td><td> 1273-50003 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> Sigma </td><td> P0899-100MG </td><td> Solución madre de 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Agua destilada </td><td> Gibco </td><td> 15230 </td><td></td></tr><tr><td> Bellas Dumont pinza no. 4 y 5 </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia (FST) </td><td> 11252-30 11241-30 </td><td></td></tr><tr><td> 20 agujas de calibre </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz medio L-15 </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> Colagenasa </td><td> Worthington </td><td> 4176 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Dispasa </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td> Solución salina equilibrada de Hank (-Ca, Mg) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM baja la glucosa </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> La insulina / transferrina / selenio </td><td> Invitrogen </td><td> 51500-056 </td><td> 100X </td></tr><tr><td> De ácidos grasos libres de BSA </td><td> Calbiochem </td><td> 126609 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> Harlan Bioproducts </td><td> 5017 </td><td></td></tr><tr><td> Ham F-12 nutriente medio (F-12) </td><td> Invitrogen </td><td> 11765 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Citosina arabinósido </td><td> Sigma </td><td> C1768 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356234 </td><td> Evitar una repetición de ciclos hielo-deshielo </td></tr><tr><td> BMP-7 </td><td> R &amp; D Systems Curis, Inc. </td><td> 345-BP-07H BMP7 </td><td> BMP 4, 5 y 6 funcionan igualmente bien como BMP-7 y son a veces más fácil de obtener comercialmente </td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Pescador </td><td> BP151-500 </td><td></td></tr><tr><td> Ratón anti-rata MAP2 anticuerpo </td><td> Sternberg Monoclonales Inc. </td><td> SMI52 </td><td> 1/5000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 cabra anti-ratón </td><td> Invitrogen </td><td> A11003 </td><td> 1/10000 </td></tr><tr><td> Medios de montaje </td><td> Prolongar sondas moleculares Antifade kit </td> &lt;td&gt; P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

inducing dendritic growth in cultured sympathetic neurons

La forma de la dendrítica cenador determina el total de entrada sináptica una neurona puede recibir 1-3, e influye en los tipos y la distribución de estas entradas 4-6. Alteración de los patrones de crecimiento dendrítico y la plasticidad se asocia con alteración de la función neuroconductual en modelos experimentales, 7, y se cree que contribuyen a los síntomas clínicos observados en los dos 8-10 trastornos del desarrollo neurológico y enfermedades neurodegenerativas 11-13. Estas observaciones ponen de relieve la importancia funcional de, precisamente, la regulación de la morfología dendrítica, y sugieren que la identificación de los mecanismos que controlan el crecimiento dendrítico no sólo avanzar en la comprensión de cómo la conectividad neuronal está regulada durante el desarrollo normal, pero también puede dar una idea de nuevas estrategias terapéuticas para diversas enfermedades neurológicas. Estudios sobre el mecanismo de crecimiento dendrítico se vería enormemente facilitada por la disponibilidad oFA modelo de sistema que permite que las neuronas de forma experimental pasó de un estado en el que no se extienden a las dendritas de aquel en el que la elaboración de un jardín dendríticas comparable a la de sus homólogos en vivo. Los cultivos primarios de neuronas simpáticas disociadas de los ganglios cervical superior (SCG) de roedores perinatales proporcionar ese modelo. Cuando se cultiva en un medio definido en la ausencia de células gliales de suero y ganglionar, las neuronas simpáticas extender un único proceso que es axonal, y este estado unipolar persiste durante semanas o meses en cultivo 14,15. Sin embargo, la adición de proteína morfogenética ósea-7 (BMP-7) o 16,17 Matrigel 18 al medio de cultivo desencadena estas neuronas para extender múltiples procesos que cumplen los criterios morfológicos y bioquímicos y funcionales para dendritas. Las neuronas simpáticas disociadas de la SCG de los roedores perinatales y cultivadas bajo condiciones definidas son una población homogénea de las neuronas 19que respondan de manera uniforme a la actividad de las dendritas se promociona de Matrigel, BMP-7 y otras BMPs de la decapentaplegic (DPP) y 60A subfamilias 17,18,20,21. Es importante destacar que Matrigel y BMP-inducida dendrita formación se produce en ausencia de cambios en la supervivencia de las células o el crecimiento axonal 17,18. Aquí se describe cómo configurar cultivos disociados de neuronas simpáticas derivadas de la SCG perinatales de las ratas para que sean sensibles a los selectivos de la dendrita de promoción de la actividad de Matrigel o BMP.

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Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Se describe un protocolo para el uso de la proteína morfogenética ósea-7 (BMP-7) o Matrigel para inducir de manera selectiva el crecimiento dendrítico en la enseñanza primaria neuronas simpáticas disociadas de los ganglios cervical superior (SCG) de las ratas perinatales.

Inducir el crecimiento dendríticas en las neuronas simpáticas cultivadas

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

La recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) de fluorescencia de proteínas marcadas en las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Investigación

Neurociencias

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Análisis cuantitativo de Reposición Synaptic piscina vesículas en cultivos de neuronas granulares del cerebelo con tintes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Sensibles al voltaje Dye grabación de axones, dendritas y espinas dendríticas de las neuronas individuales en rodajas de cerebro

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Formación de imágenes pHluorin-etiquetados Inserción del receptor a la membrana plasmática en neuronas primarias de ratón en cultivo

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo de rata primaria utilizando Estructurado Iluminación Microscopía

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Cuantificación de endosomas y de las motilidades de los lisosomas en neuronas cultivadas utilizando sondas fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Medición de endocitosis vesícula sináptica en neuronas Hippocampal cultivadas

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...