Name: functional calcium imaging in developing cortical networks
Uploaded: 2011-10-22T14:00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks at JoVE.com

Arbejde i laboratoriet er støttet af Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO) (917.10.372) til risikohåndteringsforanstaltninger. JD er medlem af EU FP7 BrainTrain program ( <a href="http://www.brain-train.nl">www.brain-train.nl</a> ). Vi takker Pieter Laurens-Baljon og Sabine Schmitz (begge CNCR, VU University Amsterdam) for billeder af FP multielectrode række kurver og neuronale kulturer bruges i videosekvens.

1. Realiseringen af ​​horisontal entorhinal-hippocampus hjernen skiver Entorhinal-hippocampus hjerne skiver er lavet ved hjælp anatomiske guider, beskrevet i en 3D overblik over regionen i henhold til Canto, Wouterlood &amp; Witter (2008) Neural Plasticitet ID 381243 9. <ol><li> Gør 500ml af skive løsning, oxygenat med carbogen gas (95% ilt, 5% kuldioxid) i mindst 20 minutter og derefter fryse 250ml indtil ice. Minutter før udskæring, knuse og blend den skive isen med de resterende 250 ml boblende skive løsning der skal anvendes til dissektion og til at skære i udskæring kammeret. </li><li> Gør 200ml af r-ACSF (nyttiggørelse ACSF) og mindst 500ml af e-ACSF (eksperimentel ACSF) opløsning. Løbende oxygenat begge løsninger med carbogen gas (95% ilt, 5% kuldioxid) i mindst 20 minutter før væv forberedelse. </li><li> Denne protokol gælder for mus fra postnatal dag 0 på op til maksimalt 3 uger gammel. Halshugge de animal, i henhold til lokale etiske komité procedurer, og dissekere ud hjernen hurtigt i en petriskål, som indeholder iskold skive klargjort i trin 1, ovenfor (se tabel 1 for løsninger og reagenser). </li><li> Overfør hjernen på et filtrerpapir vædet med skive løsning og adskille de to hjernehalvdele med et skarpt barberblad. Overfør en halvkugle tilbage til is-kold skive løsning. </li><li> Fjern lillehjernen af ​​de andre halvkugle. Flip hjernen på sin midterlinjen og skar toppen af ​​hjernen med en lille vinkel mod rostralt slutningen. </li><li> Flip hjernen på de afskårne (dorsale) overflade og lim det på væv indehaveren af ​​pålægsmaskine hovedet ved forsigtigt at skubbe med en vatpind. </li><li> Skær 300 μm tykke hjernen skiver med en lav frekvens og hastighed i de resterende iskolde skive løsning lavede på trin 1. I henhold til vores betingelser, bruger vi en Thermo Fisher Scientific vibratome (microM, HM 650V) på indstillingerne 0,05 mm / s og 36Hz. </li><li> Somsnart en skive er skåret, overføre det til en skive holder (neddykket), der indeholder iltet Kunstige Cerebro Spinal Fluid (ACSF) (2.5mm Mg 2 +, 1,6 mm Ca 2 +, se tabel 2) ved stuetemperatur. En højere magnesium koncentration i R-ACSF reducerer tilstrømningen af ​​calcium i neuroner via NMDA-receptorer efter udskæring, og i vores erfaring, fører til en bedre kvalitet af skiver til eksperimenter. Hvis det er nødvendigt, skæres den anden hjernehalvdel bagefter. </li><li> Lad skiverne i en time at komme sig. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Skær opløsning (i mm) - 10 </td></tr><tr><td> 110 </td><td> cholinchlorid </td></tr><tr><td> 25 </td><td> NaHCO 3 </td></tr><tr><td> 11,6 </td><td> 11,6 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> D-glucose </td></tr><tr><td> 7 </td><td> MgCl 2 </td></tr><tr><td> 3,1 </td><td> sodiumpyruvate </td></tr><tr><td> 2,5 </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 1,25 </td><td> NaH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 0,5 </td><td> CaCl 2 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Opskrift på skive løsning. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> ACSF (i mm) </td></tr><tr><td> 125 </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 26 </td><td> NaHCO 3 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> D-glucose </td></tr><tr><td> 3 </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 2.5/1.5 </td><td> MgCl 2 (genvinding / eksperiment) </td></tr><tr><td> 1,6 </td><td> CaCl 2 </td></tr><tr><td> 1,25 </td><td> NaH 2 PO 4 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Opskrift på både nyttiggørelse (R-ACSF) og eksperimentelle (e-ACSF) løsning. 2. Forberedelse af farvning lmrav At indlæse celler med calcium-afhængige indikator eller celle-specifikke markør, skiver nødt til at blive overført til en afdeling for farvningsprocedure. Selv om de kommercielle kamre kan være til rådighed, kan man let blive samlet fra standard lab-udstyr til meget små omkostninger. De vigtigste elementer i en sådan afdeling, er, at skiverne er opvarmet til mellem 30 og 35 ° C, inkuberes i et stadigt iltet medium, og at kammeret er afskærmet mod lys. <ol><li> Ved hjælp af en opvarmet stang, lave et lille hul i sidevæggen af ​​to engangs polystyren petriskåle (35 og 100 mm diameter), som er lige stor nok til, at en del af silicium slange (diameter ca 1,5 mm) til at passere igennem. </li><li> Tråd silicium slange gennem hullet i den lille petriskål og danner en løkke inde i indervæggen af ​​den lille skål. </li><li> Brug superlim til at forsegle den åbne ende af slangen og stok resten af ​​slangen til den indre væg af petriskålen. </li&gt; <li> Ved hjælp af en nål, gør fine huller på jævnt mellemrum i slangerne i det indre petriskål. </li><li> Lim de mindre petriskålen inde i de større en, med både tilpasset huller. Før den anden ende af silicium slange gennem hullet i muren af ​​de større petriskål. </li><li> For grænsefladen parabol, tage en cellekultur indsætte godt med semi-permeabel membran, og ved hjælp af en opvarmet skalpel, skæres den øverste 1 cm væk for at efterlade en dyb tallerken til at holde skiver under inkubation. </li><li> På låget af de større petriskål, lave et hul ca. 0,5-1cm diameter for at muliggøre carbogen (95% O 2, 5% CO 2) til at flyde ind i kammeret. </li><li> Tag en 5 eller 10 ml plastik sprøjte. Ved hjælp af en opvarmet skalpel, en vinklet skære gøre at fjerne enden af ​​sprøjten og holde et par cm længde sprøjte røret med spidsen. Ved hjælp af superlim, snitfladen i sprøjten røret tillægger petriskål låget, over den 0,5-1 cm diameter hul. </li><li> Vedhæft silicium slanger og påubing stik til sprøjten. Vedhæft en anden slange stik til silicium slangen ind i bunden af ​​petriskåle. </li><li> Tilslut op begge rør til en regulator til carbogen (95% O 2, 5% CO 2) forsyning. Placer farvning kammeret på en varm plade til udrugning mellem 30-35 ° C. Sørg for, kammer kan være afskærmet mod lys under hele inkubation processen. Farvningen kammer er nu klar til at samle og bruge til skive inkubation. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3550/3550methodologyfig1.jpg" alt="Metode Figur 1" /> Metode Figur 1. Snit af farvningen Afdeling viser slice inkubering (ovenfor) og anvendelse af calcium-følsomme indikator (pipetterede grønt farvestof, nedenfor). 3. Farvning af skiver Igennem nogen håndtering involverer fluorescerende farvestoffer, undgå fotoblegning ved at arbejde med lidt lys og holde farvestof og tHan farvede væv i mørke mellem håndtering. <ol><li> Sæt farvning kammeret på en varme plade (35 ° C), skal du tilslutte den til en carbogen gasforsyning og fyld den med cirka 1,5 ml R-ACSF fra den skive holderen. </li><li> Placer grænseflade fadet i farvning kammer og fyld den med 1 ml ACSF. </li><li> Sikre en god carbogen levering i farvningen kammer for at holde ACSF boblende på en blid, jævn hastighed. </li><li> Tilføje 9 μl DMSO og 1 ml pluronic syre (20% i DMSO stamopløsning, Invitrogen) i et hætteglas på 50 mg Fura 2-AM. Vortex farvestoffet blandingen i 15 minutter. </li><li> Overfør skiverne i grænsefladen fad og pipette farven i F-ACSF direkte over hippocampus og entorhinal cortex region af interesse, som angivet i Metode figur 1 (ovenfor), at opnå en endelig farvestof koncentration af 50mm. </li><li> Luk låget til farvning kammeret og inkuber farvestoffet i 20 - 40 minutter afhængigt af dyrets alder (se tabel 3). </li><li> TransFer skiverne tilbage i skive holderen. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Alder (postnatale dage) </td><td> Inkubationstiden (min) </td></tr><tr><td> &lt;P8 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> P8-P9 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> P10-P11 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> P12-13 </td><td> 35 </td></tr><tr><td> &gt; P13 </td><td> 40 </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Inkuberingstider til forskellige aldre, empirisk bestemt i laboratoriet. 4. Andre farvestoffer og ældre væv Måske på grund af øget myelination i hjernevævet, gør skiver fra ældre gnavere ikke tage op Fura 2-AM ester, der nemt. For at lette optagelsen af dette farvestof en inkubation skridt hjælp Cremophor EL (Sigma) anvendes til hjernen på mus på P13 og ældre 11. Cremophor er et non-ionisk overfladeaktivt bruges som hjælpestof i mange farmaceutiskeal applikationer. Uden dette trin, finder vi, at celle-specifikke mærkning er ekstremt dårlig og inkonsekvent i hele kortikale skive. <ol><li> Overførsel gamle skiver i en lavvandet inkubation fad fyldt med 3 ml r-ACSF og 8 μl 0,5% Cremophor (Sigma) opvarmes til 35 ° C i 3 minutter. </li><li> Overfør skiverne i grænsefladen fad og følge den normale farvningsproceduren (trin 4-7, se ovenfor). </li></ol> Calcium farvestoffer belastning både neuroner og ikke-neuroner i den skive forberedelse. At identificere og skelne mellem disse celletyper inden for netværket, kan sulforhodamine 101 (SR101) kan anvendes til mærkning astrocytter i skive. Farvning af skiver til sulforhodamine 101 Følg trin 1-3 som før (afsnit 3). Tag 1 ml af 10mM stamopløsning af sulforhodamine (Sigma) fra deres oplagring på -20 ° C og opløses i 999 μl r-ACSF at give en 10 ìm løsning. Pipette den lilla farve ovis i skiver som før (trin 5-7), forlader skiver inkubation i en periode på 15 minutter. Mikroglia og endotelceller er mærket med anvendelse af FITC tomat lectin farvestof Følg trin 1-3 som før. Tag 25 μl af 2mg/ml Lycopersicon esculentum (tomat) lectin FITC-konjugat (L0401, Sigma) stamopløsning i 2,5 ml r-ACSF til at give 20 mg / ml koncentration. Pipette farvestoffet i løbet af de skiver som før (trin 5-7), forlader skiver inkubation i en periode på 45 minutter. Bemærk, det er ikke muligt at kombinere dette farvestof med et calcium-følsomme indikator lignende Fura 2-AM eller Oregon Green BAPTA-1 (OGB-1), der fluorescerer i det grønne område af spektret, da fotoner fra begge farvestoffer vil blive udledt ved overlappende bølgelængder. Men der er andre calcium-indikator-farvestoffer såsom calcium orange, Fura Red, der kan anvendes i kombination med passende filtre eller Texas-Rød lektin konjugater at kombinere with calcium-indikator-farvestoffer i det grønne spektrum. 5. Montering af skiver til optagelse kammer Under billeddannelse skiver skal være stabile under mikroskop. Normalt en metal harpe er i stand til at holde det væv, men det kan ujævnt fordreje overfladen af ​​den skive, der giver kun en del af synsfelt for billeddannelse i fokus. For at undgå dette, er skiver fast til den optagelse, kammer med Polyethylenimine (PEI). <ol><li> Forbered PEI opløsning (1 ml Polyethyleneimine løsning i 250ml borsyre buffer (tabel 4)). Sørg for, PEI er fuldstændigt opløst (røre natten over). </li><li> Fyld optagelsen kamre med PEI løsning, så bunden er dækket med væske mindst en time før, du ønsker at anvende skiver </li><li> Vask optagelsen kamre med destilleret vand og derefter med R-ACSF fra bedriften kammeret. </li><li> Overfør en skive ind i en optagelse kammer. </li><li> Fjern r-ACSF med en pipette og placere slis i midten med en børste. </li><li> Fjern r-ACSF omkring skive med stykker af filterpaper. For stabilitet og overholdelse, er det vigtigt, at der ikke er ACSF omkring skive længere. </li><li> Pipette ca 0,5-1ml ACSF, afhængigt af størrelsen af ​​optagelsen kammeret, på den skive. ACSF skal blot dække den skive overfladen. </li><li> Sæt optagelsen kammeret med den skive i en stor fugtet grænseflade container, perfunderet med carbogen, og lad skiver dækket i mindst en time. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> PEI løsning </td></tr><tr><td> 1ml </td><td> Poly (ethylenimin) opløsning </td></tr><tr><td> i 250ml borsyre buffer </td><td></td></tr><tr><td> 40MM </td><td> borsyre </td></tr><tr><td> 10mM </td><td> natrium tetraborate decahydratet </td></tr></tbody></table> Tabel 4. Opskrift PEI løsning. 6. Imaldring Calcium-afhængige indikator farvestoffer kan filmede med enten én-eller to-foton mikroskopi. Anvendelse af to-foton billedbehandling kun aktiveres indikator farvestof i det centrale volumen i regionen af ​​interesse, og dermed reducere mængden af ​​lys scatter i vævet. Desuden er det muligt bedre dybde penetration af lys ind i skive. For funktionelle calcium billeddannelse bruger vi en Titanium safir laser leveret af Sammenhængende koblet til et Olympus mikroskop med et 20x objektiv (NA 0,95) og et Trimscope system ved LaVision Biotec. Det Trimscope systemet kan ramme scanning med 64 beamlets samtidigt og er kombineret med en Hamamatsu C9100 EM-CCD-kamera til hurtige frame-scanning satser. <ol><li> Placer optagelse kammeret under lup og etablere en stabil perfusion med imaging e-ACSF (1,6 Ca 2 + / 1,5 mg 2 +-forhold (tabel 2)) opvarmes til en mere fysiologisk temperatur på minimum 30 ° C. </li><li> FOCos ind i den region of interest (ROI) ved hjælp af hvidt lys belysning. Undgå at udsætte skive for lys længere end nødvendigt. </li><li> Vælg den bølgelængde, billedbehandling synsfelt, scanning frekvens, pixeltæthed og yderligere software indstillinger, der gælder for de væv og biologiske signaler, du ønsker at måle. For calcium netværk billeddannelse med Fura 2-AM vi typisk vælger en bølgelængde på 820nm, en 250x250 μm billeddannelse synsfelt, en linescanning frekvens på 1200Hz og 2-i-2 binning. Dette resulterer i en frametime på ca 100ms og dermed en imaging frekvens på ca 10Hz. </li><li> Tjek, om din ROI er i fokus ved hjælp af en kontinuerlig scanning mode og udvalgte bølgelængde på laserlys. Juster fokus og laser intensitet for at undgå pixel mætning og blegning af dit billede. </li><li> Lav en timelapse film af dit investeringsafkast. Vi typisk får to timelapse film af 2000 frames hver. </li><li> For celle detektion og identifikation, tage en z-stak ved hjælp af en stepsize på 1 m og imag<html> e + / 20 μm omkring din filmede fly af fokus. </li></ol> 7. Repræsentative resultater Vellykket læsning af calcium indikatorer, er Fura 2-AM vist i figur 1 i udviklingslande neocortical og entorhinal cortex netværk ved hjælp af multiphoton billeddannelse. Nogle farvestof er stadig til stede som baggrundsfarvning i vævet, men cellen Soma og i nogle tilfælde, proksimal dendritter er klart synlige og adskilt fra omkringliggende neuropil. Hvis du ilægger ikke har været en succes, er meget lille celle-specifik farvning observeret og små klynger af farvestof pletter er ofte synlige på skive overfladen i døde membran vragrester. I disse screenshots, er netværket af celler klart synlige i et enkelt fly af fokus for samtidig cell imaging. Brug af en metal harpe eller ufuldstændig stikning skive til optagelsen kammer kan resultere i en ujævn skive overflade, der skal afbildes. 550fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figur 1 &quot;/&gt; Figur 1. Fura 2-AM ester-loaded udvikle neocortical (A, til venstre) og entorhinal (B, til højre) netværk. Skala barer 100 mM. For at adskille neuroner fra astrocytter, co-anvendelse af sulforhodamine 101 med Fura 2-AM ester muliggør adskillelse af celletyper i netværket. <img src="/files/ftp_upload/3550/3550fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Astrocyte mærkning med sulforhodamine 101. En Co-mærkning af Fura 2-AM ester og sulforhodamine 101. Excitation bølgelængde: 820nm. Billede samlingen på PMTs med dichroic spejlet i 560/70nm for bølgelængde separation. B Repræsentant fluorescens spor fra en neuron (ovenfor) og en astrocyte (nedenfor). Skala barer 60 sek, ΔF 10 (au Fluo). <img src="/files/ftp_upload/3550/3550fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. FITC-konjugeret Lycopersicon esculentum (tomat) lectin farvning<html> . Mærkning af mikroglia og endotelceller i udviklingen af mus hippocampus (A) og overfladisk entorhinal cortex (B). Calcium indikator farvestoffer er vant til at læse-out aktivitet fra flere celler samtidigt i udviklingen af ​​cortex og hippocampus netværk. Figur 4. Dynamisk calcium transienter i hippocampus og kortikale netværk. Movie 1: Fura 2-AM ester belastning af musen entorhinal cortex i løbet af andet postnatal uge. <a href="/files/ftp_upload/3550/3550movie1.avi">Klik her for at se film 1.</a> Movie 2: Fura 2-AM ester belastning af musen hippocampus i den første postnatale uge. <a href="/files/ftp_upload/3550/3550movie2.avi">Klik her for at se filmen 2.</a> Film 3: Fluo-4 lastning af mus cortex, i den første postnatale uge. 50movie3.avi &quot;&gt; Klik her for at se filmen 3. I tilfælde af Fura 2-AM ester, celle aktivering indebærer en depolarisering-induceret tilstrømning af calcium, nedsætter farvestof fluorescens. For farvestoffer, såsom Fluo-4, er det modsatte sandt, og cellen depolarisering er observeret en stigning i foton-emissionerne. Somatiske calcium transienter er primært måles, men aktiviteten i større proksimale dendritter kan også ses i nogle præparater, som vist i Movie 2. Udlæsning af netværk aktivitet kan kvantificeres ved hjælp af kommercielle eller in-house software scripts. I vores lab, celle-identifikation og netværksaktivitet måles og analyseres i et semi-automatiseret måde at bruge in-house-kode for Matlab (MathWorks). <img src="/files/ftp_upload/3550/3550fig5.jpg" alt="Figur" /> Figur 5. Repræsentativ undersøgelse af synkroniseret calcium transienter fra et udviklingsland cortical netværk. 3D gengivelsen af et neuron ( <strong&gt; A), der anvendes til automatisk at oprette en neuron maske (B) fra en z-stak til automatiseret neuron detektion. Målinger af calcium transienter omfatter amplitude, frekvens og # af aktive celler, der kan læses ud fra en enkelt neuron data (C). Synkroni mellem forskellige spor kan visualiseres ved hjælp af et raster-plot (D).

<ol>
	<li>Katz, L. C., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+and+the+construction+of+cortical+circuits.">Synaptic activity and the construction of cortical circuits.</a> Science. 274, 1133-1138 (1996).</li><li>Khazipov, R., Luhmann, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+patterns+of+electrical+activity+in+the+developing+cerebral+cortex+of+humans+and+rodents.">Early patterns of electrical activity in the developing cerebral cortex of humans and rodents.</a> Trends in Neurosciences. 29, 414-418 (2006).</li><li>Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+activity+in+early+neuronal+development.">Electrical activity in early neuronal development.</a> Nature. 444, 707-712 (2006).</li><li>Adelsberger, H., Garaschuk, O., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+calcium+waves+in+resting+newborn+mice.">Cortical calcium waves in resting newborn mice.</a> Nat. Neurosci. 8, 988-990 (2005).</li><li>Garaschuk, O., Linn, J., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+oscillatory+calcium+waves+in+the+immature+cortex.">Large-scale oscillatory calcium waves in the immature cortex.</a> Nat. Neurosci. 3, 452-459 (2000).</li><li>Lamblin, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroencephalography+of+the+premature+and+term+newborn.+Maturational+aspects+and+glossary.">Electroencephalography of the premature and term newborn. Maturational aspects and glossary.</a> Neurophysiol. Clin. 29, 123-219 (1999).</li><li>Rakic, P., Komuro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+receptor/channel+activity+in+neuronal+cell+migration.">The role of receptor/channel activity in neuronal cell migration.</a> J. Neurobiol. 26, 299-315 (1995).</li><li>Spitzer, N. C., Root, C. M., Borodinsky, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+neuronal+differentiation:+patterns+of+Ca2++spikes+specify+transmitter+choice.">Orchestrating neuronal differentiation: patterns of Ca2+ spikes specify transmitter choice.</a> Trends. Neurosci. 27, 415-421 (2004).</li><li>Canto, C. B., Wouterlood, F. G., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+the+anatomical+organization+of+the+entorhinal+cortex+tell+us.">What does the anatomical organization of the entorhinal cortex tell us.</a> Neural. Plast. , 381243-381243 (2008).</li><li>Bureau, I., Shepherd, G. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+development+of+functional+and+anatomical+columns+in+the+neocortex.">Precise development of functional and anatomical columns in the neocortex.</a> Neuron. 42, 789-801 (2004).</li><li>Ikegaya, Y., Le Bon-Jego, M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+imaging+of+cortical+network+activity+with+calcium+indicators.">Large-scale imaging of cortical network activity with calcium indicators.</a> Neuroscience research. 52, 132-138 (2005).</li></ol>

LaVision Biotec GmbH (Bielefeld, Tyskland) sponsoreret indsendelse honorarer til dette manuskript artikel.

De metoder, vi viser her, viser egnet protokoller for calcium billeddannelse af netværket dynamik fra identificerbare celler med udvikling cortex og hippocampus netværk i mus og også hos rotter hjernen. Disse metoder giver optimal rumlig opløsning til at visualisere et lokalt netværk af celle listen over SOMA samtidig til at måle suprathreshold aktivitet. Tidslige opløsning af netværk aktivitet kan varieres, afhængigt af rammens erhvervelse CCD kameraets indstillinger, for at optimere signal: støjmålinger for lang varighed suprathreshold begivenheder, der typisk findes i u-nervesystemet. Disse protokoller er ikke begrænset til hippocampus og kortikale netværk, men også mærkning af celler i hele udviklingen af ​​nervesystemet. Begrænsningen ved denne metode er, at kun suprathreshold aktivitet kan registreres.

functional calcium imaging in developing cortical networks

Kendetegnende mønster af aktivitet i udviklingen af ​​nervesystem er spontan, synkroniseret netværksaktivitet. Synchronized aktiviteten er blevet observeret i intakte rygmarv, hjernestammen, nethinde, cortex og dissocierede neuronale kultur præparater. I perioder med spontan aktivitet, depolarisere neuroner til at fyre en enkelt eller udbrud af aktionspotentialer, aktivere mange ionkanaler. Depolarisering aktiverer spændingsafhængige calcium kanaler på dendritter og pigge at mægle calciumindløb. Meget synkroniseret elektriske aktivitet er blevet målt fra lokale neuronale netværk ved hjælp af feltet elektroder. Denne teknik gør det muligt for høj tidslig samplingfrekvenser men lavere rumlig opløsning på grund af integreret udlæsning af flere neuroner på en elektrode. Enkelt celle opløsning af neuronale aktivitet er muligt ved hjælp af patch-clamp elektrofysiologi på enkelte neuroner til at måle fyring aktivitet. Er dog evnen til at måle fra et netværk begrænset til antallet af neuroner lappet simultaneously, og typisk er der kun én eller to neuroner. Brugen af ​​calcium-afhængige fluorescerende indikator farvestoffer har gjort det muligt at måle synkroniseret aktivitet på tværs af et netværk af celler. Denne teknik giver både høj rumlig opløsning og tilstrækkelig tidsmæssig prøver at registrere spontane aktivitet udvikle netværk. Et centralt træk ved nyligt danner kortikale og hippocampus netværk i præ-og tidlige postnatale udvikling er spontan, synkroniseret neuronal aktivitet (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). Denne korrelerede netværk aktivitet menes at være afgørende for den generation af funktionelle kredsløb i udviklingslandene nervesystem (Spitzer, 2006). I både primat og gnavere hjernen, er tidligt elektrisk og calcium netværk bølger observeret præ-og postnatalt in vivo og in vitro (Adelsberger et al, 2005;. Garaschuk et al, 2000;.. Lamblin et al, 1999). Disse tidlige aktivitet mønstre, som er kendt for at kontrollere flereudviklingsmæssige processer, herunder neuronal differentiering, synaptogenesis og plasticitet (Rakic ​​&amp; Komuro, 1995;. Spitzer et al, 2004) er af afgørende betydning for korrekt udvikling og modning af det kortikale kredsløb. I denne JOVE video, viser vi de anvendte metoder til billede spontane aktivitet i udviklingen af ​​kortikale netværk. Calcium-følsomme indikatorer, såsom Fura 2-AM ester diffuse over cellemembranen, hvor intracellulære esteraseaktivitet spalter AM estere til at forlade cellen-impermeant form for indikator farvestof. Den impermeant form Indikatoren er carboxylsyre grupper, som er i stand til så opdage og binder calcium ioner intracellulært .. Fluorescens af calcium-følsomme farvestof er forbigående ændret ved binding til calcium. Single eller multi-foton billeddiagnostiske teknikker anvendes til at måle ændringen i fotoner udsendt fra den farvestof, og dermed indikerer en ændring i intracellulær calcium. Desuden er disse calcium-dependent indikatorer kan kombineres med andre fluorescerende markører for at undersøge celletyper inden for det aktive netværk.

Watch this Scientific Journal Video about Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks at JoVE.com

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks (Video) | JoVE

Spontan aktivitet for at udvikle neurale netværk kan måles ved hjælp af AM-ester former for calcium-følsomme indikator farvestoffer. Ændringer i intracellulært calcium, hvilket tyder på neuronal aktivering, der detekteres som forbigående ændringer i indikatoren fluorescens med en-eller to-foton billedbehandling. Denne protokol kan tilpasses til en række udviklingshæmmede afhængige neuronale netværk<em&gt; In vitro</em&gt;.

Funktionel Calcium Imaging i udviklingslandene Kortikal Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG (Video) | JoVE

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain (Video) | JoVE

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans (Video) | JoVE

In vivo Neuronal Calcium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration (Video) | JoVE

Hurtig Mikro-iontophoresis af glutamat og GABA: et nyttigt redskab til Undersøge Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex (Video) | JoVE

Live-Imaging mitosens i udviklingslandene mus embryonale Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin (Video) | JoVE

In vivo Funktionel Brain Imaging tilgang baseret på Bioluminescent Calcium Indikator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat (Video) | JoVE

Samtidige optagelser af kortikale lokale felt potentialer, elektrokardiogram, Electromyogram og vejrtrækning rytmen fra en frit bevægende rotte

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice (Video) | JoVE

In Vivo To-foton billeddannelse af kortikale neuroner i Neonatal mus

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive (Video) | JoVE

In vivo Calcium Imaging i Mus Ringere Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Reliable Acquisition of Electroencephalography Data during Simultaneous Electroencephalography and Functional MRI

Reliable Acquisition of Electroencephalography Data during Simultaneous Electroencephalography and Functional MRI (Video) | JoVE

Pålidelig erhvervelse af elektroencefalografidata under samtidig elektroencefalografi og funktionel MR-scanning

Simultaneous electroencephalography (EEG) and functional magnetic resonance imaging (fMRI), EEG-fMRI, combines the complementary properties of scalp EEG ...