Name: detection and isolation of circulating melanoma cells using photoacoustic flowmetry
Uploaded: 2011-11-25T13:00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry at JoVE.com

Vi erkjenner støtte fra Department of Biological Engineering og Christopher S. Bond Life Sciences Center ved University of Missouri. Vi erkjenner stipend støtte fra Missouri Livet Sciences Research Board 09-1034 og NIH R21CA139186-0. Vi takker også de miljø-og biovitenskap Undergraduate Research Opportunity Program ved University of Missouri, University of Missouri Molecular Cytologi Core, og University of Missouri College of Engineering for økonomisk støtte.

1. Blood prøveopparbeidelse <ol><li> Tegn ca 10 ml fullblod fra en Stage IV kreftpasient i to 5 mL vacutainers. </li><li> Sentrifuger rørene i ti minutter ved 3000 omdreininger per minutt (rpm). </li><li> Blodprøven vil skille i tre forskjellige lag: det nederste laget består av erytrocytter, det midterste laget, også kalt Buffy Coat, inneholder leukocytter og melanom celler, og det øverste laget inneholder plasma og blodplater. Fjern så mye plasma som mulig uten å forstyrre Buffy Coat. </li><li> Plasser 250 mL av Histopaque 1077 i to 1 mL Wintrobe rør. </li><li> Ved hjelp av en 9 &quot;Pasteur pipette, trekke de resterende plasma, hele Buffy Coat, og selv det øverste laget av erytrocytter, og pass på å samle &lt;500 mL. </li><li> Plasser løsningen på toppen av Histopaque laget og Sentrifuger Wintrobe rørene i 15 ml koniske rør i 10 minutter ved 3000 rpm. </li><li> Blodet vil igjenseparate, men denne gangen erytrocytter vil bli atskilt av Histopaque, muliggjør enkel ekstraksjon av Buffy Coat. Bruk en 9 &quot;Pasteur pipette å få hele Buffy Coat og legg den i en 2 mL Eppendorf rør. </li><li> Suspendere Buffy Coat i 1,5 mL PBS med 2% v / v Tween 20. </li></ol> 2. Flow Chamber Konstruksjon <ol><li> Motta akryl sylinder, 20 mm ytre diameter, 17 mm indre diameter og 8 mm høy. Bor tre 5 mm diameter hull gjennom siden av sylinderen på 90 graders vinkler fra hverandre. Skjær tre stykker av polymer tubing (1,6 mm innvendig diameter, 5 mm ytre diameter), og plassere dem inn i hullene. </li><li> Strekk Parafilm over bunnen av akryl ringen for å gjøre en vanntett forsegling. Den Parafilm danner en grunn bolle med akryl ringen, og vil holde akrylamid løsning som vil danne en flyt chamber. </li><li> Suspendere en 1,6 mm diameter ledning gjennom deler av slangen som er på tvers avhverandre, og pass på at ledningen alene er synlig gjennom midten av ringen. Fyll den tredje stykke rør med en 1,6 mm diameter wire og posisjon røret 1 mm unna suspendert ledningen. Disse ledningene hindrer akrylamid kommer inn i slangen. Etter akrylamid stivner, ledningene vil bli trukket ut, og etterlater en sylindrisk strømningsbanen og et sted å plassere en optisk fiber fokuserer på strømningsbanen. </li><li> Tilsett 5 ml forberedt akrylamid [20 g akrylamid (Sigma Aldrich), 0,7 g bisacrylamide (Sigma Aldrich), 100 mL destillert vann] til et lite begerglass. Mål opp 0,02 g ammonium persulfate (Sigma) og legge den til begerglasset. Bland med en bevegelse bar i 3 minutter. Tilsett 20 mL tetramethylethylenediamene (Fisher Scientific) til begerglasset. Raskt hell røren i akryl ringen, fylle til toppen. Etter noen sekunder vil løsningen gel, gjør en flyt chamber mold. Trekk ledningene ut, og pass på ikke å forstyrre akrylamid gel. Flyten ChamBER er nå klar til bruk. </li></ol> 3. Photoacoustic flowmetry set-up <ol><li> Akustisk par en polyvinylidene fluor piezoelektrisk akustisk svinger (Panametrics) til en flyt kammer ved hjelp av ultralyd gel direkte over strømningsbanen. </li><li> Ved hjelp av en Bayonet Neill-Concelman (BNC) kabel, kobler svingeren til inngangen på en RITEC Broadband Receiver-640A (Lavpassfilter: ut, highpass filter: 1 MHz, imput impedans: 50 ohm, forsterkning: 35 dB). Koble utgangen av filteret til oscilloskop (Tektronix TDS 2024B). For å utløse oscilloskop, er en fotodiode (Thorlabs) satt opp i nærheten svingeren og er koblet til oscilloskopet med en BNC-kabel. </li><li> En t-kontakt (Small Parts) er festet til en arm av flyten kammeret. To sprøyte pumper (Braintree Scientific) er koblet til den andre grener av kontakten. En sprøyte inneholder luft, mens den andre vil inneholde cellesuspensjonen utarbeidet i del 1. Sett flow priser til100 mL / minutt. </li><li> Pakk den lille slangen på flyten kammeret til en liten lomme av luft former, og sett en 1 mm diameter kjerne optisk fiber med en 0,37 numerisk apertur i det sporet. Fyll lommen med vann for å redusere grensesnitt signaler og øke mengden av laserlys brukes til strømningsbanen. På grunn av den numerisk apertur av optiske fiber og kort avstand til strømningsbanen, vil laseren bare strålebehandling en slug av prøven til enhver tid, slik at prøven rett foran laseren er den samme prøven skape photoacoustic signaler. Laseren energi bør være ca 28 mJ / cm 2 med litt størrelse på 7 mm 2. </li><li> Slå både sprøyte pumper på. Når de to blandbare væsker nå t-krysset de vil bli partisjonert i homogen snegler og flyt forbi svingeren. </li><li> Strålebehandling den strømmende prøven med et nanosekund pulset laser for å generere photoacoustic bølger i melanom cellene. Ettersom melanin er en broadbog optisk absorber, kan noen synlige laser bølgelengde brukes. </li><li> Hvis et signal vises på oscilloskopet når en slug er på toppen av svinger, inneholder slug melanom, og kan spores gjennom systemet til å slippe inn en samling hetteglass. </li></ol> Fire. Immunocytochemistry <ol><li> Ta fanget sneglene til en Cytospin 4 Sentrifuger (Thermo Scientific) for å fikse dem til glass lysbilder. Plasser glass glir inn Cytofunnels (Shandon EZ Enkel Cytofunnel med Brown Filter kort Thermo Scientific) og laste dem inn i Cytospin 4 Centrifuge. Sett 100 mL av 1% Bovine serum albumin (Sigma) i PBS i hver trakt og så sentrifuger ved 600 rpm i 3 minutter for å hjelpe fanget cellene holde seg til glasset lysbilder. </li><li> Etter sentrifugering, legger celleprøver til Cytofunnels og sentrifuger ved 600 rpm i 3 minutter. Så spray lysbildene med en etanol basert fiksativ. </li><li> Vask lysbildene i PBS i 10 minutter to ganger. </li><li&gt; For å blokkere uspesifikk binding, inkuber hvert lysbilde med en blanding av 10 mL of Goat Serum (Sigma) og 90 mL av PBS i 1 time ved romtemperatur. </li><li> Etter inkubering, dekanter lysbilder og inkuber med den primære antistoffet løsningen for 1 time i en fuktet kammer ved romtemperatur. Hver side skal inneholde 1% MART-1 antistoff oppvokst i kanin, 1% CD-45-antistoff oppvokst i mus, 10% Goat serum, og 89% PBS. </li><li> Etter inkubasjon, vask lysbildene i PBS i 10 minutter tre ganger. </li><li> Lysbildene blir deretter inkubert i en sekundær antistoff løsning, som har fluoroforen bundet til antistoffer. Blandingen inneholder 0,05% geit anti-kanin antistoff, 0,05% geit anti-mus antistoff, 0,1% geit serum, og 99% PBS. Lysbildene inkuberes i mørke i en time ved romtemperatur. </li><li> Etter inkubasjon dekanter lysbildene vask i PBS i 5 minutter tre ganger. </li><li> Å farge for en kjerne, Inkuber cellene med 0,1 mikrogram / mL DAPI (Invitrogen) for1 minutt. Så dekanter lysbilder og vask i PBS. </li><li> Montere et dekkglass over celleprøve bruker 20 mL av en harpiks-basert montering media per lysbilde. Tett dekkglass med klar neglelakk for å bevare lysbildet. Nå lysbildene er klar til å bli fotografert med et fluorescerende mikroskop. </li></ol> 5. Representant Resultater: <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig1.jpg" alt="Figur 1"/> Figur 1. Den photoacoustic bølgeformer fra hvite blodceller og melanom celler er vist her. De hvite blodcellene, har ingen iboende pigmentering, produserer ingen photoacoustic bølger og manifest som en flat linje av elektronisk støy (til venstre). Den pigmenterte melanom cellene produserer et robust photoacoustic bølge (høyre). <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig2.jpg" alt="Figur 2"/> Figur 2. Etter immunocytochemical flekker, cultured melanom celler show DAPI signaler i blue mens MART1 er uthevet i grønt. <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig3.jpg" alt="Figur 3"/> Figur 3. Overliggende bilder for DAPI og MART1, som i figur 2, med CD45 som en indikator på leukocytter, viser dette tallet melanom celler blant flere hvite blodlegemer.

<ol>
	<li>Pantel, K., Brakenhoff, R., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells.">Detection clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature Reviews Cancer. 8, 329-340 (2008).</li><li>Pantel, K., Brakenhoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+metastatic+cascade.">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nature Reviews Cancer. 4, 448-456 (2004).</li><li>Yu, M., Stott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells:+approaches+to+isolation+and+characterization.">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of Cell Biology. 192, 373-373 (2011).</li><li>Weight, R. M., Dale, P. S., Viator, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+melanoma+cells+in+human+blood+using+photoacoustic+flowmetry.">Detection of circulating melanoma cells in human blood using photoacoustic flowmetry.</a> , 106-109 (1985).</li><li>Weight, R. M., Dale, P. S., Lisle, A., Caldwell, C., Viator, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoacoustic+detection+of+metastatic+melanoma+cells+in+the+human+circulatory+system.">Photoacoustic detection of metastatic melanoma cells in the human circulatory system.</a> Opt. Lett. 31, 2998-3000 (2006).</li><li>Gupta, A., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+geometry+on+droplet+formation+in+the+squeezing+regime+in+a+microfluidic+T-junction.">Effect of geometry on droplet formation in the squeezing regime in a microfluidic T-junction.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 8, 799-812 (2010).</li><li>Mocellin, S., Hoon, D., Ambrosi, A., Nitti, D., Rossi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prognostic+value+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+melanoma:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">The prognostic value of circulating tumor cells in patients with melanoma: a systematic review and meta-analysis.</a> Clinical Cancer Research. 12, 4605-4605 (2006).</li><li>Cristofanilli, M., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Matera, J., Miller, M., Reuben, J., Doyle, G., Allard, W., Terstappen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells,+disease+progression,+and+survival+in+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 351, 781-781 (2004).</li><li>Cristofanilli, M., Hayes, D., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Reuben, J., Doyle, G., Matera, J., Allard, W., Miller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells:+a+novel+prognostic+factor+for+newly+diagnosed+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells: a novel prognostic factor for newly diagnosed metastatic breast cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 23, 1420-1420 (2005).</li><li>Ghossein, R., Scher, H., Gerald, W., Kelly, W., Curley, T., Amsterdam, A., Zhang, Z., Rosai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+localized+and+metastatic+prostatic+carcinoma:+clinical+implications.">Detection of circulating tumor cells in patients with localized and metastatic prostatic carcinoma: clinical implications.</a> Journal of Clinical Oncology. 13, 1195-1195 (1995).</li><li>Loberg, R., Fridman, Y., Pienta, B., Keller, E., McCauley, L., Taichman, R., Pienta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+isolation+of+circulating+tumor+cells+in+urologic+cancers:+a+review.">Detection and isolation of circulating tumor cells in urologic cancers: a review.</a> Neoplasia. 6, 302-302 (2004).</li><li>Viator, J. A., Gupta, S. K., Goldschmidt, B. S., Bhattacharyya, K., Raghuraman, R., Shukla, R., Dale, P. S., Boote, E., Katti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+gold+nanoparticle+enhanced+prostate+cancer+cells+using+photoacoustic+flowmetry+with+optical+reflectance.">Detection of gold nanoparticle enhanced prostate cancer cells using photoacoustic flowmetry with optical reflectance.</a> J. Biomed. Nanotech. 6, 187-191 (2010).</li></ol>

John A. Viator er grunnlegger og president i Viator Technologies Inc, et selskap dannet for å kommersialisere photoacoustic teknologi for forbedring av menneskers helse.

Oppdage CTCs er fortsatt et forsknings-intensive felt med svært få kliniske applikasjoner på grunn av vanskelige problemet med å isolere de sjeldne kreftceller. Mange andre teknikker blir evaluert for CTC deteksjon, inkludert RT-PCR, microfluidic celle fangst, immunomagnetiske fangst, og andre metoder 8-12. Men photoacoustic deteksjon av CMCs viser løfte som det er etiketten gratis og gir en rask og nøyaktig måte å fange små, lette å absorbere partikler. Protokollen er beskrevet å isolere hvite blodlegemer er svært effektiv, men likevel et lavt antall røde blodceller finnes i prøven. Disse rouge forurensende cellene også absorbere laserlys, men på et sterkt redusert nivå. For å sikre de røde blodcellene ikke forstyrre våre melanom detection system ble fem sunne pasientprøver introdusert gjennom systemet, og ingen ga et signal, som indikerer at røde blod celler er til stede ved lave nok konsentrasjoner til åses bort fra. En rekke konsentrasjon studier har vært utført med dyrkede melanom celler og photoacoustic flow system har vist seg sensitiv ned til en celle / mL (upubliserte data). Disse studiene er på gang og snart vil omfatte forsøk med kreft pasientprøver. Dette photoacoustic teknikken blir også evaluert for bruk i ikke-pigmenterte CTCs, som brystkreft og prostatakreft ved å feste eksogene chromophores. Vi har utført forberedende arbeid med gull nanopartikler på kreft cells13. Disse testene har vist at nanopartikler kan gi den nødvendige optiske absorpsjon å generere photoacoustic bølger. De resterende tekniske utfordringen er å knytte slike partikler til kreftceller selektivt.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection and isolation of circulating melanoma cells using photoacoustic flowmetry

Sirkulerende tumorceller (CTCs) er de cellene som har skilt fra en makroskopisk tumor og spres gjennom blod og lymfe-systemer til frø sekundære svulster 1,2,3. CTCs er indikatorer av metastatisk sykdom og deres oppdagelse i blodprøver kan brukes til å diagnostisere kreft og overvåke pasientens respons på behandlingen. Siden CTCs er sjeldne, bestående om en svulst celle blant milliarder av normale blodceller i avanserte kreftpasienter, deres påvisning og telling er en vanskelig oppgave. Vi utnytter tilstedeværelsen av pigment i de fleste melanom cellene til å generere photoacoustic, eller laser indusert ultrasoniske bølger i en egendefinert flowcytometer for påvisning av sirkulerende melanom celler (CMCs) 4,5. Denne prosessen innebærer å skille en fullblodsprøve bruker sentrifugering og innhenting av hvite blodlegemer lag. Hvis stede i fullblod, vil CMCs skille med de hvite blodcellene grunn til lignende tetthet. Disse cellene er resuspendert ifosfatbufret saltvann (PBS) og introdusert i strømningsmåleren. Snarere enn en kontinuerlig strøm av blod cellesuspensjonen, induserte vi to fase strøm for å fange opp disse cellene for videre studier. I to fase strøm, to blandbare væsker i en microfluidic system møtes på et knutepunkt og danne vekslende slugs av flytende 6,7. PBS suspendert hvite blodlegemer og luft danner mikroliter slugs som er sekvensielt bestrålt med laserlys. Tillegg av en surfactant til væskefasen lar uniform slug formasjon og brukeren kan opprette forskjellige størrelser slugger ved å endre forbruk av de to fasene. Snegler av luft og snegler av PBS med hvite blodceller inneholder ingen lys absorbenter og dermed ikke produserer photoacoustic bølger. Men slugs av hvite blodceller som inneholder enda enkelt CMCs absorbere laserlys og produserer høyfrekvente akustiske bølger. Disse snegler som genererer photoacoustic bølger er isolert og samlet for cytochemical farging for verificasjon av CMCs.

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry at JoVE.com

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Vi har utviklet et flowcytometer bruker laser indusert ultralyd til å påvise sirkulerende melanoma celler som en tidlig indikator på metastatisk sykdom.

Deteksjon og Isolering av Sirkulerende Melanom Cells bruke photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Rask Isolering av Levedyktige sirkulerende tumorceller fra pasient Blodprøver

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

Bakteriell Detection &amp; Identification hjelp elektrokjemiske sensorer

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Integrert Photoacoustic ophthalmoscopy og Spectral-domene optisk koherens tomografi

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

Photoacoustic Cystography

Photoacoustic cystografi

Conventional pediatric cystography, which is based on diagnostic X-ray using a radio-opaque dye, suffers from the use of harmful ionizing radiation. The ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantasjon av indusert pluripotent stamcelle-avledet Mesoangioblast-lignende myogene forfedre i musemodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Etikett-free enkelt molekyl Detection Bruke Microtoroid Optiske resonatorer

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Utarbeidelse og Foto-akustisk analyse av Cellular Kjøretøy inneholder gull nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Sirkulasjons mikroRNA Kvantifisering Bruke DNA-bindende Dye kjemi og Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Byttbar akustisk og optisk oppløsning Photoacoustic Microscopy for<em&gt; In vivo</em&gt; Små dyr blodprodusering av blodkar

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the ...