Name: modified yeast-two-hybrid system to identify proteins interacting with the growth factor progranulin
Uploaded: 2012-01-17T13:00:00
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Este trabalho foi financiado por verbas de pesquisa NIH K01AR053210, R01AR061484 e uma bolsa da Fundação Nacional de Psoríase.

1. Informação de fundo A levedura sistema de hibridação é uma poderosa técnica genética usado para descobrir interações proteína-proteína 16, 17. Vários tipos de sistemas híbridos de 2, como LexA sistemas baseados, o Sistema de Recrutamento Sos e bactérias ou células de mamíferos baseadas em dois híbridos, são comerciais disponíveis, este trabalho concentra-se especificamente sobre as modificações dos mais comumente usados ​​GAL4 base sistema de levedura 2-h...

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	<li>He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progranulin+is+a+mediator+of+the+wound+response.">Progranulin is a mediator of the wound response.</a> Nat. Med. 9, 225-229 (2003).</li><li>Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteinase+3+and+neutrophil+elastase+enhance+inflammation+in+mice+by+inactivating+antiinflammatory+progranulin.">Proteinase 3 and neutrophil elastase enhance inflammation in mice by inactivating antiinflammatory progranulin.</a> J. Clin. 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Biol. 181, 37-41 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+progranulin+cause+tau-negative+frontotemporal+dementia+linked+to+chromosome+17.">Mutations in progranulin cause tau-negative frontotemporal dementia linked to chromosome 17.</a> Nature. 442, 916-919 (2006).</li><li>Cruts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Null+mutations+in+progranulin+cause+ubiquitin-positive+frontotemporal+dementia+linked+to+chromosome+17q21.">Null mutations in progranulin cause ubiquitin-positive frontotemporal dementia linked to chromosome 17q21.</a> Nature. 442, 920-924 (2006).</li><li>Guo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulin-epithelin+precursor+binds+directly+to+ADAMTS-7+and+ADAMTS-12+and+inhibits+their+degradation+of+cartilage+oligomeric+matrix+protein.">Granulin-epithelin precursor binds directly to ADAMTS-7 and ADAMTS-12 and inhibits their degradation of cartilage oligomeric matrix protein.</a> Arthritis Rheum. 62, 2023-2036 (2010).</li><li>Feng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulin+epithelin+precursor:+a+bone+morphogenic+protein+2-inducible+growth+factor+that+activates+Erk1/2+signaling+and+JunB+transcription+factor+in+chondrogenesis.">Granulin epithelin precursor: a bone morphogenic protein 2-inducible growth factor that activates Erk1/2 signaling and JunB transcription factor in chondrogenesis.</a> FASEB. J. 24, 1879-1892 (2010).</li><li>Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+oligomeric+matrix+protein+associates+with+granulin-epithelin+precursor+(GEP)+and+potentiates+GEP-stimulated+chondrocyte+proliferation.">Cartilage oligomeric matrix protein associates with granulin-epithelin precursor (GEP) and potentiates GEP-stimulated chondrocyte proliferation.</a> J. Biol. Chem. 282, 11347-11355 (2007).</li><li>Liu, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ADAMTS-7+and+ADAMTS-12+in+the+pathogenesis+of+arthritis.">The role of ADAMTS-7 and ADAMTS-12 in the pathogenesis of arthritis.</a> Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 5, 38-45 (2009).</li><li>Liu, C., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waxman,+S.G.+Fibroblast+growth+factor+homologous+factor+1B+binds+to+the+C+terminus+of+the+tetrodotoxin-resistant+sodium+channel+rNav1.9a+(NaN).">Waxman, S.G. Fibroblast growth factor homologous factor 1B binds to the C terminus of the tetrodotoxin-resistant sodium channel rNav1.9a (NaN).</a> J. Biol. Chem. 276, 18925-18933 (2001).</li><li>Liu, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAMTS-7:+a+metalloproteinase+that+directly+binds+to+and+degrades+cartilage+oligomeric+matrix+protein.">ADAMTS-7: a metalloproteinase that directly binds to and degrades cartilage oligomeric matrix protein.</a> FASEB. J. 20, 988-990 (2006).</li><li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growth+Factor+Progranulin+Binds+to+TNF+Receptors+and+Is+Therapeutic+Against+Inflammatory+Arthritis+in+Mice.">The Growth Factor Progranulin Binds to TNF Receptors and Is Therapeutic Against Inflammatory Arthritis in Mice.</a> Science. 332, 478-484 (2011).</li><li>Wu, H., Siegel, R. 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Triagem levedura híbrida de dois provou ser uma ferramenta eficaz na identificação de interação proteína 16, 17. Em comparação com outras abordagens para a identificação de proteínas de ligação de parceiros, como a bioquímica co-purificação de proteínas e chips, levedura híbrida de dois sistemas é uma abordagem sensível genética que pode ser usado para screening um grande número de seqüências de codificação em um experimento relativamente simples, em Além disso, ele detecta a intera...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> ProQuest sistema de dois híbridos </td><td> Invitrogen </td><td> 10835 </td></tr><tr><td> YPD Meio de Crescimento </td><td> Clontech </td><td> 630409 </td></tr><tr><td> YPD Agar Médio </td><td> Clontech </td><td> 630410 </td></tr><tr><td> Base de Dados de agar mínimo SD </td><td> Clontech </td><td> 630412 </td></tr><tr><td> -Leu DO Suplemento </td><td> Clontech </td><td> 630414 </td></tr><tr><td> -Leu/-Trp DO Suplemento </td><td> Clontech </td><td> 630417 </td></tr><tr><td> -His/-Leu/-Trp/-Ura DO Suplemento </td><td> Clontech </td><td> 630425 </td></tr><tr><td> 3-Amino-1 ,2,4-triazol (3AT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8056 </td></tr><tr><td> Luria caldo (LB) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3022 </td></tr><tr><td> X-Gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520-034 </td></tr><tr><td> DNA de esperma de salmão sonicado </td><td> Stratagene </td><td> 201190 </td></tr><tr><td> Ampicilina </td><td> AMRESCO </td><td> 0339 </td></tr><tr><td> Sulfato de canamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 11815-024 </td></tr><tr><td> Eficiência subclonagem ™ DH5α ™ células competentes </td><td> Invitrogen </td><td> 18265-017 </td></tr><tr><td> Trizma ® de base </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6066 </td></tr><tr><td> Acetato de lítio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L4158 </td></tr><tr><td> Ácido etilenodiaminotetracético </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> ED </td></tr><tr><td> Membrana de nitrocelulose </td><td> Bio-Rad </td><td> 162-0115 </td></tr><tr><td> 10 cm de placa de Petri </td><td> ITI Scientific </td><td> CT-903 </td></tr><tr><td> Incubadora (30 ° C) </td><td> ATR (Ecotron) </td><td></td></tr></table>

modified yeast-two-hybrid system to identify proteins interacting with the growth factor progranulin

Progranulina (PGRN), também conhecido como precursor granulin epithelin (GEP), é um fator de crescimento 593-amino-ácido autócrina. PGRN é conhecida por desempenhar um papel crítico em uma variedade de processos fisiológicos e de doença, incluindo a embriogênese precoce, uma cicatrização de feridas, inflamação 2, 3 e 4 de defesa do hospedeiro. PGRN também funciona como um fator neurotrófico 5, e as mutações no gene PGRN resultando em perda parcial da demência frontotemporal causa proteína PGRN 6, 7. Nossos estudos recentes têm levado ao isolamento de PGRN como um importante regulador da cartilagem desenvolvimento e degradação 8-11. Embora PGRN, descoberto há quase duas décadas, desempenha um papel crucial em várias condições fisiológicas e patológicas, os esforços para explorar as ações de PGRN e entender os mecanismos envolvidos foram significativamente prejudicada pela nossa incapacidade de identificar a sua ligação ao receptor (s). Para resolver este problema, desenvolvemos um modicados levedura híbrida de dois (MY2H) abordagem baseada no mais comumente usados ​​GAL4 sistema 2-híbrido baseado. Comparado com o convencional levedura tela dois híbridos, MY2H reduz drasticamente o processo de tela e reduz o número de falsos positivos clones. Além disso, esta abordagem é reproduzível e confiável, e temos empregada com sucesso este sistema para isolar as proteínas de ligação de iscas diversas, inclusive de canal iônico, 12 de proteínas da matriz extracelular 10, 13, e fator de crescimento 14. Neste artigo, descrevemos este procedimento MY2H experimental em detalhe usando PGRN como um exemplo que levou à identificação de TNFR2 conhecido como o primeiro receptor PGRN associada 14, 15.

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Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Nós modificamos o fermento convencional de dois híbridos de rastreamento, uma ferramenta eficaz na identificação genética de interação de proteínas. Esta modificação marcadamente encurta o processo, reduz a carga de trabalho, eo mais importante, reduz o número de falsos positivos. Além disso, esta abordagem é reproduzível e confiável.

Modificado Sistema Yeast-Two-Hybrid para identificar proteínas Interagindo com o Fator de Crescimento progranulina

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Research

JoVE Journal

Biology

Growth Factor-Coated Bead Placement on Dorsal Forebrain Explants

Fator-Revestido crescimento Placement Bead em explantes Encéfalo anterior Dorsal

Biologia

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

Fator de Crescimento colocando-Revestido Beads em embriões de galinha Early Stage

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Preparando-se Fator de Crescimento de Células T esplenócitos Rat

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. ...

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Proteômica para identificar proteínas Interagindo com P2X2 Canais Ligand-Gated Cation

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitina Yeast Membrana Baseado Two-Hybrid (MITO) do sistema: uma ferramenta poderosa para identificação de interações proteína-proteína

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - um método para identificar em toda a Transcriptoma Sítios de Ligação de Proteínas RNA Binding

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

Reverter levedura Sistema de dois híbridos para identificar mamíferos Receptor Nuclear Resíduos que interagem com ligantes e / ou antagonistas

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Captura de Espectrometria de Massa Compound - uma ferramenta poderosa para identificar novos c-di-GMP efetoras Proteínas

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Promoter Using Gibson Assembly

Geração de plasmídeo vectores que expressam proteínas marcadas-bandeira nos termos do regulamento de Alongamento Human Fator-1α Promotor Usando Assembleia Gibson

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...