Name: modified yeast-two-hybrid system to identify proteins interacting with the growth factor progranulin
Uploaded: 2012-01-17T13:00:00
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Este trabajo fue financiado por el NIH subvenciones para la investigación K01AR053210, R01AR061484 y una beca de la Fundación Nacional de Psoriasis.

1. Información general La levadura de dos sistema híbrido es una poderosa técnica genética utilizada para descubrir las interacciones proteína-16, 17. Varias clases de dos híbridos de sistemas, tales como la serie LEXA-los sistemas basados ​​en el sistema de contratación Sos, y las bacterias o células de mamíferos base-2-híbridos, son comerciales disponibles, en este documento se centra específicamente en las modificaciones de las más utilizadas GAL4 base levadura de...

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	<li>He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progranulin+is+a+mediator+of+the+wound+response.">Progranulin is a mediator of the wound response.</a> Nat. Med. 9, 225-229 (2003).</li><li>Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteinase+3+and+neutrophil+elastase+enhance+inflammation+in+mice+by+inactivating+antiinflammatory+progranulin.">Proteinase 3 and neutrophil elastase enhance inflammation in mice by inactivating antiinflammatory progranulin.</a> J. Clin. Invest. 118, 2438-2447 (2008).</li><li>Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+proepithelin+to+epithelins:+roles+of+SLPI+and+elastase+in+host+defense+and+wound+repair.">Conversion of proepithelin to epithelins: roles of SLPI and elastase in host defense and wound repair.</a> Cell. 111, 867-878 (2002).</li><li>Yin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exaggerated+inflammation,+impaired+host+defense,+and+neuropathology+in+progranulin-deficient+mice.">Exaggerated inflammation, impaired host defense, and neuropathology in progranulin-deficient mice.</a> J. Exp. Med. 207, 117-128 (2010).</li><li>Van Damme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progranulin+functions+as+a+neurotrophic+factor+to+regulate+neurite+outgrowth+and+enhance+neuronal+survival.">Progranulin functions as a neurotrophic factor to regulate neurite outgrowth and enhance neuronal survival.</a> J. Cell. Biol. 181, 37-41 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+progranulin+cause+tau-negative+frontotemporal+dementia+linked+to+chromosome+17.">Mutations in progranulin cause tau-negative frontotemporal dementia linked to chromosome 17.</a> Nature. 442, 916-919 (2006).</li><li>Cruts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Null+mutations+in+progranulin+cause+ubiquitin-positive+frontotemporal+dementia+linked+to+chromosome+17q21.">Null mutations in progranulin cause ubiquitin-positive frontotemporal dementia linked to chromosome 17q21.</a> Nature. 442, 920-924 (2006).</li><li>Guo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulin-epithelin+precursor+binds+directly+to+ADAMTS-7+and+ADAMTS-12+and+inhibits+their+degradation+of+cartilage+oligomeric+matrix+protein.">Granulin-epithelin precursor binds directly to ADAMTS-7 and ADAMTS-12 and inhibits their degradation of cartilage oligomeric matrix protein.</a> Arthritis Rheum. 62, 2023-2036 (2010).</li><li>Feng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulin+epithelin+precursor:+a+bone+morphogenic+protein+2-inducible+growth+factor+that+activates+Erk1/2+signaling+and+JunB+transcription+factor+in+chondrogenesis.">Granulin epithelin precursor: a bone morphogenic protein 2-inducible growth factor that activates Erk1/2 signaling and JunB transcription factor in chondrogenesis.</a> FASEB. J. 24, 1879-1892 (2010).</li><li>Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+oligomeric+matrix+protein+associates+with+granulin-epithelin+precursor+(GEP)+and+potentiates+GEP-stimulated+chondrocyte+proliferation.">Cartilage oligomeric matrix protein associates with granulin-epithelin precursor (GEP) and potentiates GEP-stimulated chondrocyte proliferation.</a> J. Biol. Chem. 282, 11347-11355 (2007).</li><li>Liu, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ADAMTS-7+and+ADAMTS-12+in+the+pathogenesis+of+arthritis.">The role of ADAMTS-7 and ADAMTS-12 in the pathogenesis of arthritis.</a> Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 5, 38-45 (2009).</li><li>Liu, C., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waxman,+S.G.+Fibroblast+growth+factor+homologous+factor+1B+binds+to+the+C+terminus+of+the+tetrodotoxin-resistant+sodium+channel+rNav1.9a+(NaN).">Waxman, S.G. Fibroblast growth factor homologous factor 1B binds to the C terminus of the tetrodotoxin-resistant sodium channel rNav1.9a (NaN).</a> J. Biol. Chem. 276, 18925-18933 (2001).</li><li>Liu, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAMTS-7:+a+metalloproteinase+that+directly+binds+to+and+degrades+cartilage+oligomeric+matrix+protein.">ADAMTS-7: a metalloproteinase that directly binds to and degrades cartilage oligomeric matrix protein.</a> FASEB. J. 20, 988-990 (2006).</li><li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growth+Factor+Progranulin+Binds+to+TNF+Receptors+and+Is+Therapeutic+Against+Inflammatory+Arthritis+in+Mice.">The Growth Factor Progranulin Binds to TNF Receptors and Is Therapeutic Against Inflammatory Arthritis in Mice.</a> Science. 332, 478-484 (2011).</li><li>Wu, H., Siegel, R. 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Levadura de dos híbridos de cribado ha demostrado ser una herramienta eficaz en la identificación de la interacción de proteínas 16, 17. En comparación con otros métodos para la identificación de la proteína de unión de la pareja, tales como la purificación bioquímica de proteínas y co-chips, dos híbridos de levadura es un enfoque sensible genética que puede ser utilizado para la detección de un número muy alto de las secuencias codificadoras de un experimento relativamente sencillo, en Ademá...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> ProQuest sistema híbrido de dos </td><td> Invitrogen </td><td> 10835 </td></tr><tr><td> YPD medio de crecimiento </td><td> Clontech </td><td> 630409 </td></tr><tr><td> YPD medio Agar </td><td> Clontech </td><td> 630410 </td></tr><tr><td> Mínimo SD Base de agar </td><td> Clontech </td><td> 630412 </td></tr><tr><td> -Leu se complementa </td><td> Clontech </td><td> 630414 </td></tr><tr><td> -Leu/-Trp Se complementa </td><td> Clontech </td><td> 630417 </td></tr><tr><td> -His/-Leu/-Trp/-Ura Se complementa </td><td> Clontech </td><td> 630425 </td></tr><tr><td> 3-amino-1 ,2,4-triazol (3AT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8056 </td></tr><tr><td> Caldo Luria (LB) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3022 </td></tr><tr><td> X-Gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520-034 </td></tr><tr><td> Salmón sonicado ADN de los espermatozoides </td><td> Stratagene </td><td> 201190 </td></tr><tr><td> Ampicilina </td><td> Amresco </td><td> 0339 </td></tr><tr><td> Kanamicina sulfato </td><td> Invitrogen </td><td> 11815-024 </td></tr><tr><td> Eficiencia subclonación ™ ™ DH5a células competentes </td><td> Invitrogen </td><td> 18265-017 </td></tr><tr><td> Trizma ® base </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6066 </td></tr><tr><td> Acetato de litio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L4158 </td></tr><tr><td> Ácido etilendiaminotetraacético </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> ED </td></tr><tr><td> Membrana de nitrocelulosa </td><td> Bio-Rad </td><td> 162-0115 </td></tr><tr><td> 10 cm de una caja de petri </td><td> ITI Científico </td><td> CT-903 </td></tr><tr><td> Incubadora (30 ° C) </td><td> ATR (Ecotron) </td><td></td></tr></table>

modified yeast-two-hybrid system to identify proteins interacting with the growth factor progranulin

Progranulina (PGRN), también conocido como precursor granulina epithelin (GEP), es un factor de crecimiento autocrino 593-amino-ácido. PGRN se sabe que juega un papel crítico en una variedad de procesos fisiológicos y enfermedades, incluyendo principios de la embriogénesis, cicatrización de heridas 1, la inflamación 2, 3 y 4 de defensa del huésped. PGRN también funciona como un factor neurotrófico 5, y las mutaciones en el gen PGRN resultando en la pérdida parcial de la demencia frontotemporal causa PGRN proteínas 6, 7. Nuestros estudios recientes han conducido al aislamiento de PGRN como un importante regulador del desarrollo del cartílago y la degradación de 8-11. A pesar de PGRN, descubierto hace casi dos décadas, juega un papel crucial en varias condiciones fisiológicas y patológicas, los esfuerzos para aprovechar las acciones de PGRN y entender los mecanismos implicados han sido considerablemente obstaculizada por nuestra incapacidad para identificar su unión al receptor (s). Para solucionar este problema, hemos desarrollado una modiFIED dos híbridos de levadura (MY2H) enfoque basado en el más utilizado GAL4 basada en dos sistema híbrido. En comparación con la levadura convencional de dos híbridos de pantalla, MY2H reduce drásticamente el proceso de la pantalla y reduce el número de falsos positivos clones. Además, este método es reproducible y confiable, y hemos empleado con éxito este sistema en el aislamiento de las proteínas de unión de diversos cebos, incluidos los canales de iones 12, proteína de la matriz extracelular 10, 13, 14 y factor de crecimiento. En este trabajo se describe el procedimiento experimental MY2H en detalle utilizando PGRN como ejemplo, que condujo a la identificación de TNFR2 como el primero conocido PGRN asociada a los receptores 14, 15.

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Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Hemos modificado la levadura de dos híbridos convencionales de detección, una herramienta eficaz en la identificación genética interacción de proteínas. Esta modificación notable acorta el proceso, reduce la carga de trabajo, y lo más importante, reduce el número de falsos positivos. Además, este método es reproducible y confiable.

Modificado levadura sistema híbrido de dos para identificar proteínas que interactúan con el factor de crecimiento progranulina

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Research

JoVE Journal

Biology

Growth Factor-Coated Bead Placement on Dorsal Forebrain Explants

Factor de crecimiento-Coated colocación de bolas de explantes cerebro anterior dorsal

Investigación

Biología

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

La colocación de crecimiento recubierto Factor-bolas en los embriones tempranos de la etapa de pollo

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

La preparación de Factor de Crecimiento Celular T a partir de esplenocitos de rata

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. ...

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Proteómica para identificar proteínas que interactúan con los canales de cationes P2X2 ligando

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-ubiquitina levadura membrana base de dos híbridos (MITO) del sistema: Una poderosa herramienta para identificar interacciones proteína-proteína

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - un método para identificar transcriptoma en todo los sitios de unión de las proteínas de unión a ARN

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

Invierta levadura de dos sistema híbrido para identificar mamíferos Receptor Nuclear Residuos que interactúan con ligandos y / o antagonistas

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Captura compuesto Espectrometría de Masas - Una herramienta de gran alcance para identificar nuevos c-di-GMP efectoras Proteínas

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Promoter Using Gibson Assembly

Generación de plásmidos vectores que expresan proteínas de la bandera de etiquetado bajo la regulación del promotor factor de elongación humano-1α Usando Asamblea Gibson

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...