Name: assessing somatic hypermutation in ramos b cells after overexpression or knockdown of specific genes
Uploaded: 2011-11-01T13:00:00
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O pMSCV-AID-I-Thy1.1 e pKat2 vetores foram um presente amável da DG Schatz eo pVSV-G, PRSV-Rev, e pMDLg / pRRE vetores foram um presente amável da BR Cullen.

1. Amostras de preparação e células <ol><li> Realizar uma preparação de médio porte de DNA (midiprep) da superexpressão ou shRNA contendo construções e as embalagens retroviral vector pKat2 ou os vetores embalagem lentiviral pVSV-G, pMDLg / pRRE e PRSV-Rev 25. Use 6 mg DNA para cada construção e ou mcg 4 de pKat2 (para infecções retrovirais) ou 1,5 mg de DNA para cada um dos pVSV-g, pMDLg / pRRE, e vetores PRSV-Rev embalagem (para infecções lentiviral). </li><li> Prepare BOSC 23 meios de comu...

<ol>
	<li>Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+antibody+somatic+hypermutation.">Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).</li><li>Peled, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemistry+of+somatic+hypermutation.">The biochemistry of somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).</li><li>Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination.">AID in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> Curr. Opin. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hypermutation+at+G+and+C+nucleotides+in+immunoglobulin+variable+genes+from+mice+deficient+in+the+MSH2+mismatch+repair+protein.">Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein.</a> J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).</li><li>Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. 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Res. 25, 2985-2991 (1997).</li><li>Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+Nijmegen+breakage+syndrome+gene+NBS1+leads+to+early+embryonic+lethality+in+mice.">Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice.</a> Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).</li><li>Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mRad50+causes+embryonic+stem+cell+lethality,+abnormal+embryonic+development,+and+sensitivity+to+ionizing+radiation.">Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).</li><li>Pavri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation-induced+cytidine+deaminase+targets+DNA+at+sites+of+RNA+polymerase+II+stalling+by+interaction+with+Spt5.">Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5.</a> Cell. 143, 122-133 (2010).</li><li>Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CtIP+promotes+microhomology-mediated+alternative+end+joining+during+class-switch+recombination.">CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination.</a> Nat. Struct. Mol. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle-regulated+DNA+double-stranded+breaks+in+somatic+hypermutation+of+immunoglobulin+genes.">Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes.</a> Nature. 408, 216-221 (2000).</li><li>Parsa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+mutates+a+non-immunoglobulin+transgene+independent+of+chromosomal+position.">AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position.</a> Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).</li><li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+instability+of+V+region+hypermutation+in+the+Ramos+Burkitt's+lymphoma+cell+line.">Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line.</a> Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).</li><li>Ukai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a:T+mutations+is+dependent+on+cellular+environment+but+independent+of+mutation+frequency+and+target+gene+location.">Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location.</a> J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).</li><li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li><li>Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+class+switching+of+an+IgM++B+lymphoma+clone+CH12F3+to+IgA++cells.">High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells.</a> Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).</li><li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+expression+of+activation-induced+cytidine+deaminase+(AID),+a+novel+member+of+the+RNA-editing+deaminase+family+in+germinal+center+B+cells.">Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).</li></ol>

Como discutido anteriormente, os modelos de celular da linha de diversificação de anticorpos se tornaram um popular ponto de partida para identificar novas proteínas que influenciam diferentes etapas durante a diversificação de anticorpos. Apresentamos aqui um método para usar infecção viral às proteínas ou knock-down ou superexpressam na linha de Ramos de células B e em seguida, examinar o impacto sobre a SHM. Para esses estudos, utilizamos tanto WT Ramos e células AID oi</...

Reagentes sugerido - a maioria destes pode ser substituído por produtos similares de outros fornecedores. <table border="1" ><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th > Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td > 6-bem claro TC tratados com placas </td><td > Corning </td><td> 3516 </td><td ></td></tr><tr><td > 10 mL BD Luer-Loksyringes </td><td > BD Medical </td><td > 309604 </td><td ></td></tr><tr><td> 24 bem claro TC tratados com placas </td><td > Corning </td><td > 3526 </td><td></td></tr><tr><td > De 96 poços de poliestireno com fundo transparente plana TC-tratados microplacas </td><td > Corning </td><td > 3596 </td><td ></td></tr><tr><td > 100 milímetros TC tratados com placas de cultura </td><td > Corning </td><td > 430167 </td><td ></td></tr><tr><td > Filtros de seringa Acrodisc, 0,45 mM </td><td > Pall Life Sciences </td><td > 4604 </td><td ></td></tr><tr><td > Agar </td><td > Teknova </td><td > A7777 </td&gt; <td ></td></tr><tr><td > Agarose </td><td > GeneMate </td><td> E-3120-500 </td><td ></td></tr><tr><td > Ampicilina </td><td> Sigma </td><td > A0166 </td><td> 100 mg / mL em água </td></tr><tr><td > BD FACSCanto citômetro de fluxo II </td><td> BD Biosciences </td><td ></td><td > ou similar </td></tr><tr><td> BD Falcon poliestireno rodada tubos de fundo </td><td> BD Biosciences </td><td > 352054 </td><td > para FACS </td></tr><tr><td > BOSC 23 células </td><td > ATCC </td><td > CRL-11270 </td><td ></td></tr><tr><td > Incubadora de CO 2 capazes de 37 ° C </td><td ></td><td ></td><td ></td></tr><tr><td > DMEM (meio modificado Dulbecco Eagle) </td><td > Sigma </td><td> D6429 </td><td ></td></tr><tr><td > FBS (soro fetal bovino) </td><td > Gémeos Bio-Products </td><td > 100-106 </td><td ></td></tr><tr><td > FITC α-rato CD90/mouse CD90.1 anticorpos </td><td > BioLegend </td><td > 202503 </td><td > FITCα-Thy1.1 </td></tr><tr><td > FuGENE Reagente Transfection 6 </td><td > Roche </td><td > 11814443001 </td><td></td></tr><tr><td > Solução tampão HEPES </td><td > Invitrogen </td><td > 15630-080 </td><td ></td></tr><tr><td > KAPA DNA polimerase HiFi </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK2101 </td><td ></td></tr><tr><td > LB caldo (caldo lisogenia - Luria) Pó </td><td > Difco </td><td > 240230 </td><td ></td></tr><tr><td > MISSÃO TRC shRNA estoque glicerol bacteriana </td><td > Sigma </td><td ></td><td> vetores shRNA </td></tr><tr><td > NCS (recém-nascido soro bovino) </td><td > Gémeos Bio-Products </td><td > 100-504 </td><td ></td></tr><tr><td> PBS (solução tampão fosfato) </td><td > Invitrogen </td><td> 70011 </td><td > diluída em água para 1x </td></tr><tr><td > PE α-humano de anticorpos IgM </td><td > BioLegend </td><td > 314508 </td><td ></td></tr><tr><td > PGS (penicilina-estreptomicina-glutamina solução) </td><td > Gémeos Bio-Produtos </td><td > 400-110 </td><td ></td></tr><tr><td> Polibrene (Hexadimetrina brometo) </td><td > Sigma </td><td > 107689 </td><td > 10 mg / mL em água </td></tr><tr><td > PureYield Sistema Midiprep Plasmid </td><td > Promega </td><td > A2495 </td><td></td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma </td><td > P8833 </td><td > 250 mcg / mL em água </td></tr><tr><td > QIAquick extração de gel kit </td><td > QIAGEN </td><td > 28706 </td><td ></td></tr><tr><td> Ramos (RA 1) células </td><td > ATCC </td><td > CRL-1596 </td><td ></td></tr><tr><td > RPMI-1640 médio </td><td > Sigma </td><td > R8758 </td><td ></td></tr><tr><td > SuperScript II </td><td > Invitrogen </td><td > 18064-022 </td><td></td></tr><tr><td > SYBR RÁPIDO qPCR kit </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK4601 </td><td ></td></tr><tr><td > Taq DNA polimerase </td><td > Invitrogen </td><td > 18038-042 </td><td ></td></tr><tr><td > TOPO TA Cloning kit </td><td > Invitrogen </td><td > K4520-01 </td><td ></td></tr><tr><td > TRIzol </td><td > Invitrogen </td><td > 15596-026 </td><td ></td></tr><tr><td > Assistente de Genomic SV sistema de purificação de DNA </td><td > Promega </td><td > A2361 </td><td ></td></tr><tr><td > X-Gal [5-bromo-4-cloro-3-β-indoyl-D-galatopyranoside] </td><td > Growcells </td><td > C-5687 </td><td > 40 mg / mL em DMSO </td></tr></tbody></table>

assessing somatic hypermutation in ramos b cells after overexpression or knockdown of specific genes

Células B começam sua vida com os anticorpos de baixa afinidade gerada pela recombinação V (D) J. No entanto, após a detecção de um patógeno, a variável região (V) de um gene de imunoglobulina (Ig) é mutante aproximadamente 100.000 vezes mais do que o resto do genoma através hipermutação somática (SHM), resultando em alta de 1,2 anticorpos de afinidade. Além disso, a recombinação classe switch (CSR) produz anticorpos com diferentes funções efetoras, dependendo do tipo de resposta imune que é necessário para um determinado patógeno. Ambos RSE e SHM são iniciadas pela ativação induzida citidina desaminase (AID), que deaminatos resíduos citosina no DNA para produzir uracils. Estes uracils são processados ​​por formas propenso a erros de vias de reparo, acabou levando a mutações e recombinação 1-3. Nossa compreensão atual dos detalhes moleculares da SHM ea RSE vêm de uma combinação de estudos em camundongos, células primárias, linhas de células, e células-fexperimentos ree. Modelos de ratos permanecem o padrão-ouro com nocautes genética mostrando papéis críticos para reparar muitos fatores (por exemplo, Ung, MSH2, MSH6, Exo1 e polimerase η) 4-10. No entanto, nem todos os genes são passíveis de estudos nocaute. Por exemplo, nocautes de várias cadeias duplas proteínas de reparo estão embrionariamente quebrar letal ou prejudicar o desenvolvimento das células B 11-14. Além disso, por vezes, a função específica de uma proteína em SHM ou CSR pode ser mascarada por mais defeitos global causado pelo nocaute. Além disso, desde experimentos em camundongos pode ser demorado, alterando a expressão de genes individuais em linhas de celular tornou-se um passo cada vez mais popular primeiro a identificar e caracterizar genes candidatos 15-18. Ramos - uma linha de células de linfoma de Burkitt que constitutivamente sofre SHM - tem sido um modelo de celular da linha popular de estudo SHM 18-24. Uma vantagem das células Ramos é que eles têm uma semi built-in conveniente-Quantitativa medida da SHM. Células de tipo selvagem expressar IgM e, como eles peguem mutações, algumas das mutações knock out expressão IgM. Portanto, dosagem de perda de IgM por fluorescência-ativado de varredura de células (FACS) fornece uma rápida leitura para fora para o nível de SHM. A medida mais quantitativa da SHM pode ser obtida diretamente seqüenciamento dos genes dos anticorpos. Como as células Ramos são difíceis de transfecção, que produzem derivados estáveis ​​que têm aumentado ou abaixado expressão de um gene individual por infectar as células com construções retroviral ou lentiviral que contêm um cassete de superexpressão ou um curto hairpin RNA (shRNA), respectivamente. Aqui, descrevemos como nos infectar as células Ramos e depois usar essas células para investigar o papel de genes específicos em SHM (Figura 1).

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Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Descrevemos como executar infecções retrovirais ou lentiviral de superexpressão ou shRNA contendo constrói no ser humano Ramos linhagem de células-B e como medida de mutação somática nestas células.

Avaliação de mutação somática em células B Ramos, após superexpressão ou Knockdown de genes específicos

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Modelo murino de CD40-ativação de células B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Imunologia e Infecção

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Indução e Avaliação de recombinação mudança de classe em purificada Células B murino

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Seguindo o destino celular, em<em&gt; E. coli</em&gt; Após a infecção por um fago Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Detecção de True IgE-expressando Rato B células da linhagem

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detecção e enriquecimento da Rare células B antígeno-específica para a análise do fenótipo e função

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Sobreexpressão e purificação do ser humano<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferase em<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara B antígeno-específicas células circulantes no sangue

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

Avaliação de estresse celular e inflamação em discreta secretoras de ocitocina núcleos de cérebro em ratos Neonatal antes e depois da primeira mamada do colostro

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Análise de cisalhamento induzida pelo fluxo de migração de murino Marginal Zone B células In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...