Name: a cre-lox p recombination approach for the detection of cell fusion in vivo
Uploaded: 2012-01-04T12:00:00
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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Peiman Hemmati (Departamento de Medicina da Universidade de Wisconsin-Madison) para oferecer generosamente as CTMs H1, e Dr. Hacker Tim, Dr. Gouqing Song e Ms. Jill Koch, da Universidade de Wisconsin Fisiologia Cardiovascular Facilidade núcleo para realização de cirurgias mouse. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation através de uma Bolsa de Investigação Pós-Graduação de Brian Freeman e R21 NIH HL089679.

1. Transfection célula doadora <ol><li> Células-tronco mesenquimais da colheita (MSCs derivadas de células-tronco embrionárias H1 gentilmente doados pelo Dr. Peiman Hematti, alternativamente, qualquer tipo de célula de qualquer espécie a hipótese de fundir in vivo pode ser empregado), quando 70-80% confluente com 1X tripsina (Mediatech, Manassas VA) por 5 min. Inativar tripsina com α-MEM médio completo (livre de antibióticos, Invitrogen, Carlsbad CA) 18. Centrifugar a 300...

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	<li>Bernirschke, K. K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathology of the Human Placenta. , (2000).</li><li>Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+localization+of+chorionic+gonadotropin+alpha+and+placental+lactogen+mRNAs+during+development+of+the+human+placenta.">Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta.</a> J. Cell. Biol. 93, 190-198 (1982).</li><li>Johansen, M., Redman, C. W., Wilkins, T., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophoblast+deportation+in+human+pregnancy--its+relevance+for+pre-eclampsia.">Trophoblast deportation in human pregnancy--its relevance for pre-eclampsia.</a> Placenta. 20, 531-539 (1999).</li><li>Redman, C. W., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+debris,+oxidative+stress+and+pre-eclampsia.">Placental debris, oxidative stress and pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, 597-602 (2000).</li><li>Ogle, B. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+and+lymphoid+contribution+to+non-haematopoietic+lineages+through+irradiation-induced+heterotypic+cell+fusion.">Myeloid and lymphoid contribution to non-haematopoietic lineages through irradiation-induced heterotypic cell fusion.</a> Nat. Cell. Biol. 10, 584-592 (2008).</li><li>Kutschka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+human+BCL-2+transgene+expression+attenuates+early+donor+cell+death+after+cardiomyoblast+transplantation+into+ischemic+rat+hearts.">Adenoviral human BCL-2 transgene expression attenuates early donor cell death after cardiomyoblast transplantation into ischemic rat hearts.</a> Circulation. 114, I174-I180 (2006).</li><li>Min, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+cord+blood+derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+into+rat+myocardium.">In vivo bioluminescence imaging of cord blood derived mesenchymal stem cell transplantation into rat myocardium.</a> Ann. Nucl. Med. 20, 165-170 (2006).</li><li>Malstrom, S. E., Tornavaca, O., Meseguer, A., Purchio, A. F., West, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+characterization+and+hormonal+regulation+of+kidney+androgen-regulated+protein+(Kap)-luciferase+transgenic+mice.">The characterization and hormonal regulation of kidney androgen-regulated protein (Kap)-luciferase transgenic mice.</a> Toxicol. Sci. 79, 266-277 (2004).</li><li>Weir, L. 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Immun. 74, 2925-2936 (1090).</li><li>Kadurugamuwa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+biophotonic+imaging+for+monitoring+of+catheter-associated+urinary+tract+infections+and+therapy+in+mice.">Noninvasive biophotonic imaging for monitoring of catheter-associated urinary tract infections and therapy in mice.</a> Infect. Immun. 73, 3878-3887 (2005).</li><li>Ryan, P. L., Youngblood, R. C., Harvill, J., Willard, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+monitoring+in+real+time+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+gene+expression+under+relaxin-induced+conditions+in+a+novel+murine+wound+model.">Photonic monitoring in real time of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression under relaxin-induced conditions in a novel murine wound model.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041, 398-414 (2005).</li><li>Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+imaging+of+GFAP+expression+after+neuronal+damage+in+mice.">Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice.</a> Neurosci. Lett. 367, 210-212 (2004).</li><li>Noiseux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+overexpressing+Akt+dramatically+repair+infarcted+myocardium+and+improve+cardiac+function+despite+infrequent+cellular+fusion+or+differentiation.">Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation.</a> Mol. Ther. 14, 840-850 (2006).</li><li>Ajiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composite+tissue+transplantation+in+rats:+fusion+of+donor+muscle+to+the+recipient+site.">Composite tissue transplantation in rats: fusion of donor muscle to the recipient site.</a> Transplant Proc. 37, 208-209 (2005).</li><li>Trivedi, P., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+immunological+characterization+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells.</a> Exp. Hematol. 36, 350-359 (2008).</li><li>Ogle, B. M., Cascalho, M., Platt, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+implications+of+cell+fusion.">Biological implications of cell fusion.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 567-575 (2005).</li><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43, 25-30 (2007).</li></ol>

O método descrito aqui permite, pela primeira vez, a identificação discreta e análise temporal da fusão celular em organismos, incluindo animais de pequeno porte. A abordagem combina Cre-LoxP recombinação com análise de imagem subseqüentes biofotônica. A abordagem é passível de rastreamento não só a fusão célula-célula, mas também do vírus na célula-fusion e assim pode ser útil para rastrear infecções virais. Análise de imagem é rápida e é possível de várias imagens de pequenos animais simul...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Neon Sistema Transfection </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> MPK5000 </td><td></td></tr><tr><td> Kit Neon 100 L </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> MPK10025 </td><td> Contém R e E do buffer </td></tr><tr><td> a-MEM em pó </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> 12000-022 </td><td></td></tr><tr><td> De soro fetal bovino (FBS) </td><td> Hyclone, Logan UT </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> B6.C-Tg (CMV-CRE) 1CGN / J </td><td> Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME </td><td> 006054 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina 10X </td><td> Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ </td&gt; <td> MT-25-054-Cl </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> D-Luciferina </td><td> Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA </td><td> 122796 </td><td></td></tr><tr><td> Xenogen Imaging System biofotônica </td><td> Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA </td><td> Spectrum IVIS </td><td></td></tr><tr><td> Biocarbonate de sódio </td><td> Sigma Aldrich, St. Louis, MO </td><td> S6014-500G </td><td></td></tr><tr><td> Não-essenciais Aminoácidos </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr></tbody></table>

a cre-lox p recombination approach for the detection of cell fusion in vivo

A capacidade de duas ou mais células do mesmo tipo para fundir tem sido utilizado em metazoários ao longo da evolução para formar muitos órgãos complexos, incluindo o músculo esquelético, ossos e placenta. Estudos contemporâneos demonstram fusão de células do mesmo tipo confere função melhorada. Por exemplo, quando as células do trofoblasto do fusível placenta para formar o sinciciotrofoblasto, o sinciciotrofoblasto é mais capaz de transportar nutrientes e hormônios através da barreira materno-fetal do trofoblasto não fundido 1-4. Estudos mais recentes demonstram a fusão de células de diferentes tipos pode direcionar o destino da célula. A &quot;reversão&quot; ou modificação do destino da célula por fusão já foi pensado para ser limitada a sistemas de cultura de células. Mas o advento do transplante de células-tronco levou à descoberta por nós e outras que as células-tronco podem se fundir com as células somáticas in vivo e que a fusão facilita a diferenciação de células-tronco 5-7. Assim, fusão celular é um processo regulado capable de promover a sobrevivência e diferenciação celular e, portanto, poderia ser de importância central para o reparo, o desenvolvimento de tecidos e até mesmo a patogênese da doença. Limitar o estudo da fusão celular, é a falta de tecnologia apropriada a 1) identificar com precisão produtos de fusão e 2) produtos de fusão faixa ao longo do tempo. Aqui apresentamos uma nova abordagem para abordar tanto limitações através da indução de bioluminescência em fusão (Figura 1);. Bioluminescência pode ser detectado com alta sensibilidade in vivo 15/08 Nós utilizamos uma construção que codifica a luciferase do firefly (Photinus pyralis) gene colocado adjacente ao um códon de parada flanqueado por seqüências LoxP. Quando as células expressando este gene fusível com células expressando a proteína Cre recombinase, os sites são clivados e LoxP o sinal de parada é retirado permitindo a transcrição de luciferase. Como o sinal é inducible, a incidência de falsos-positivos sinais é muito baixa. Ao contrário dos métodos já existentes, que utilizam o sistema Cre / LoxP 16, 17, foi incorporado um &quot;viva&quot; sinal de detecção e, assim, pagar pela primeira vez a oportunidade de acompanhar a cinética de fusão celular in vivo. Para demonstrar a abordagem, os camundongos ubiquitously expressar Cre recombinase serviu como receptores de células-tronco transfectadas com uma construção para expressar a jusante luciferase de um códon de parada floxed. Células-tronco foram transplantadas via injeção intramiocárdica e depois do transplante de análise de imagem intravital foi conduzido para rastrear a presença de produtos de fusão no coração e tecidos circundantes ao longo do tempo. Esta abordagem pode ser adaptada para analisar fusão celular em qualquer tipo de tecido, em qualquer estágio da doença, desenvolvimento ou reparação de tecidos adultos.

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A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

Um método para controlar a fusão de células de organismos vivos ao longo do tempo é descrito. A abordagem utiliza Cre-<em&gt; LoxP</emRecombinação&gt; para induzir a expressão luciferase sobre fusão celular. O sinal luminoso gerado pode ser detectado nos organismos vivos utilizando sistemas de imagens biofotônica com uma sensibilidade de detecção de ~ 1.000 células nos tecidos periféricos.

A Cre-Lox Abordagem Recombinação P para Detecção de fusão celular In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

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