Name: metabolic pathway confirmation and discovery through 13c-labeling of proteinogenic amino acids
Uploaded: 2012-01-26T13:00:00
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Cette étude a été soutenue par une carrière NSF Grant (MCB0954016) et une subvention de recherche du DOE des bioénergies (DEFG0208ER64694).

1. La culture cellulaire (figure 1) <ol><li> Cultiver des cellules dans un milieu minimal avec des oligo-éléments, sels, vitamines, et les substrats de carbone spécifiquement étiquetés qui sont les meilleurs pour enquête voie. Utilisez soit des flacons secouant ou bioréacteurs pour la culture cellulaire. Nutriments organiques, tels que l&#39;extrait de levure, peuvent interférer avec la mesure de l&#39;étiquetage des acides aminés et ne peuvent donc pas être présents dans le milieu de culture. </li><li> Su...

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	<li>Zamboni, N., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+biological+insights+through+metabolomics+and+13C-flux+analysis.">Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+analysis+of+microbial+metabolic+fluxes+via+13C+isotopic+labeling.">Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling.</a> Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+carbon+metabolism+in+Dehalococcoides+ethenogenes+strain+195+via+isotopic+and+transcriptomic+analysisa.">Investigation of carbon metabolism in Dehalococcoides ethenogenes strain 195 via isotopic and transcriptomic analysisa.</a> J. Bacteriol. 191, 5224-5231 (2009).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+confirmation+and+flux+analysis+of+central+metabolic+pathways+in+Desulfovibrio+vulgaris+Hildenborough+using+GC-MS+and+FT-ICR+mass+spectrometry.">Pathway confirmation and flux analysis of central metabolic pathways in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough using GC-MS and FT-ICR mass spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 189, 940-949 (2007).</li><li>Dauner, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GC-MS+analysis+of+amino+acids+rapidly+provides+rich+information+for+isotopomer+balancing.">GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing.</a> Biotechnology Progress. 16, 642-649 (2000).</li><li>Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluxome+analysis+using+GC-MS.">Fluxome analysis using GC-MS.</a> Microbial Cell Factories. 6, 6-6 (2007).</li><li>Antoniewicz, M. R., Kelleher, J. K., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+assessment+of+amino+acid+mass+isotopomer+distributions+for+metabolic+flux+analysis.">Accurate assessment of amino acid mass isotopomer distributions for metabolic flux analysis.</a> Anal. Chem. 79, 7554-7559 (2007).</li><li>Wahl, S. A., Dauner, M., Wiechert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+mass+isotopomer+data+evaluation+in+13C+flux+analysis:+mass+isotope+correction,+data+consistency+checking,+and+precursor+relationships.">New tools for mass isotopomer data evaluation in 13C flux analysis: mass isotope correction, data consistency checking, and precursor relationships.</a> Biotechnology and Bioengineering. 85, 259-268 (2004).</li><li>Shaikh, A., Tang, Y. J., Mukhopadhyay, A., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotopomer+distributions+in+amino+acids+from+a+highly+expressed+protein+as+a+proxy+for+those+from+total+protein.">Isotopomer distributions in amino acids from a highly expressed protein as a proxy for those from total protein.</a> Analytical Chemistry. 80, 886-890 (2008).</li><li>Tang, K. -. H., Feng, X., Tang, Y. J., Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+metabolism+and+carbon+fixation+in+Roseobacter+denitrificans+OCh114.">Carbohydrate metabolism and carbon fixation in Roseobacter denitrificans OCh114.</a> PLoS One. 4, e7233-e7233 (2009).</li><li>Tang, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+flow+of+Heliobacterium+modesticaldum+is+more+related+to+Firmicutes+than+to+the+green+sulfur+bacteria.">Carbon flow of Heliobacterium modesticaldum is more related to Firmicutes than to the green sulfur bacteria.</a> J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).</li><li>Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Central+Metabolic+Pathways+in+Thermoanaerobacter+sp.+X514+via+Isotopomer-Assisted+Metabolite+Analysis.">Characterization of the Central Metabolic Pathways in Thermoanaerobacter sp. X514 via Isotopomer-Assisted Metabolite Analysis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 5001-5008 (2009).</li><li>Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixotrophic+and+photoheterotrophic+metabolisms+in+Cyanothece+sp.+ATCC+51142+under+continuous+light.">Mixotrophic and photoheterotrophic metabolisms in Cyanothece sp. ATCC 51142 under continuous light.</a> Microbiology. 156, 2566-2574 (2010).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flux+analysis+of+central+metabolic+pathways+in+Geobacter+metallireducens+during+reduction+of+soluble+Fe(III)-NTA.">Flux analysis of central metabolic pathways in Geobacter metallireducens during reduction of soluble Fe(III)-NTA.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 3859-3864 (2007).</li><li>Tang, Y. J., Meadows, A. L., Kirby, J., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+central+metabolic+pathways+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+reinterpreted+in+the+light+of+isotopic+metabolite+labeling.">Anaerobic central metabolic pathways in Shewanella oneidensis MR-1 reinterpreted in the light of isotopic metabolite labeling.</a> Journal of Bacteriology. 189, 894-901 (2007).</li><li>Zhuang, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+utilization+of+exogenous+amino+acids+by+Dehalococcoides+ethenogenes+strain+195+and+the+enhancement+resulted+to+dechloronation+activity.">Selective utilization of exogenous amino acids by Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and the enhancement resulted to dechloronation activity.</a> Appl. Environ. Microbiol. , (2011).</li><li>Feng, X., Tang, K. -. H., Blankenship, R. E., Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+flux+analysis+of+the+mixotrophic+metabolisms+in+the+green+sulfur+bacterium+Chlorobaculum+tepidum.">Metabolic flux analysis of the mixotrophic metabolisms in the green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum.</a> J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).</li><li>McKinlay, J. B., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+dioxide+fixation+as+a+central+redox+cofactor+recycling+mechanism+in+bacteria.">Carbon dioxide fixation as a central redox cofactor recycling mechanism in bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).</li><li>McKinlay, J. B., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calvin+cycle+flux,+pathway+constraints,+and+substrate+oxidation+state+together+determine+the+H2+biofuel+yield+in+photoheterotrophic+bacteria.">Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria.</a> MBio. 2, (2011).</li><li>Erb, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+C5-dicarboxylic+acids+from+C2-units+involving+crotonyl-CoA+carboxylase/reductase:+The+ethylmalonyl-CoA+pathway.">Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway.</a> PNAS. 104, 10631-10636 (2007).</li><li>Wu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoleucine+synthesis+pathway+in+cyanobacterial+species.">Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species.</a> Microbiology. 156, 596-602 (2010).</li><li>Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unicellular,+aerobic+nitrogen-ï¬xing+cyanobacteria+of+the+genus+Cyanothece.">Unicellular, aerobic nitrogen-ï¬xing cyanobacteria of the genus Cyanothece.</a> J. Bacteriol. 175, 1284-1292 (1993).</li><li>Shastri, A. A., Morgan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+isotopic+labeling+methodology+for+13C+metabolic+flux+analysis+of+photoautotrophic+microorganisms.">A transient isotopic labeling methodology for 13C metabolic flux analysis of photoautotrophic microorganisms.</a> Phytochemistry. 68, 2302-2312 (2007).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariability+of+central+metabolic+flux+distribution+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+under+environmental+or+genetic+perturbations.">Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations.</a> Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).</li><li>Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C-based+metabolic+flux+analysis.">13C-based metabolic flux analysis.</a> Nature Protocols. 4, 878-892 (2009).</li></ol>

Ce protocole consiste à alimenter la cellule avec un substrat marqué et mesurer les tendances résultant de marquage isotopique dans les acides aminés via la GC-MS. Depuis de données MS (m / z ratios) donner juste la quantité globale de l&#39;étiquetage des ions MS, nous avons à évaluer les distributions isotopomère d&#39;acides aminés en examinant les rapports m / z de deux non fragmentés (M-57) + et fragmenté des acides aminés (ie, (M-159) + et (F302) +). Par ailleurs, nou...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> TBDMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 19915 </td><td> - </td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34865 </td><td> - </td></tr><tr><td> Substrat de carbone marqué </td><td> Cambridge Isotope Laboratories </td><td> Dépendent de l&#39;exigence expérimentale </td><td> Site Web: <a href="http://www.isotope.com">http://www.isotope.com</a> </td></tr><tr><td> Chromatographe en phase gazeuse </td><td> Agilent Technologies </td><td> Hewlett-Packard, modèle 7890A </td><td> - </td></tr><tr><td> Colonnes GC </td><td> J &amp; W Scientific, Folsom, CA </td><td> DB5 (30m) </td><td> - </td></tr><tr><td> Spectromètre de masse </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5975C </td><td> - </td></tr><tr><td> Reacti-Vap EvaporAtor </td><td> Thermo Scientific </td><td> TS-18825 </td><td> Pour le séchage des échantillons d&#39;acides aminés </td></tr></tbody></table>

metabolic pathway confirmation and discovery through 13c-labeling of proteinogenic amino acids

Les microbes ont des voies métaboliques complexes qui peuvent être étudiés en utilisant des méthodes de biochimie et fonctionnelles en génomique. Une technique important d&#39;examiner le métabolisme des cellules centrales et de découvrir de nouvelles enzymes est de 13 C-analyse assistée par le métabolisme 1. Cette technique est basée sur le marquage isotopique, par lequel les microbes sont nourris avec un substrats C 13 étiquetés. En retraçant les chemins de transition entre les atomes de métabolites dans le réseau biochimique, nous pouvons déterminer les voies fonctionnelles et découvrir de nouvelles enzymes. Comme une méthode complémentaire à la transcriptomique et la protéomique, les approches de isotopomère analyse assistée par des voies métaboliques contiennent trois grandes étapes 2. Tout d&#39;abord, nous faisons pousser des cellules avec des substrats étiquetés C 13. Dans cette étape, la composition du milieu et la sélection des substrats marqués sont deux facteurs clés. Pour éviter les bruits de mesure à partir de carbone non-étiquetées dans les suppléments nutritifs, Un milieu minimal avec une seule source de carbone est nécessaire. En outre, le choix d&#39;un substrat marqué est basé sur l&#39;efficacité avec laquelle il élucider la voie en cours d&#39;analyse. Parce que de nouvelles enzymes impliquent souvent la stéréochimie réaction différente ou des produits intermédiaires, en général, substrats carbonés individuellement étiquetés sont plus informatifs pour la détection de nouvelles voies que celles marqué uniformément pour la détection de trois nouvelles voies, 4. Deuxièmement, nous analysons les modèles d&#39;étiquetage aminés acides par GC -SM. Les acides aminés sont abondants dans les protéines et peuvent ainsi être obtenus par hydrolyse de la biomasse. Les acides aminés peuvent être dérivés par la N-(tert-butyldiméthylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) avant la séparation GC. TBDMS dérivés des acides aminés peuvent être fragmentés par MS et aboutir à des tableaux différents de fragments. Basé sur la masse à charge (m / z) Le ratio des fragmentée et non fragmentés d&#39;acides aminés, on peut en déduire les motifs possibles de l&#39;étiquette centrale métabolites qui sontprécurseurs des acides aminés. Troisièmement, nous traçons les transitions de carbone 13C dans les voies proposées et, sur la base de données isotopomère, confirmer si ces voies sont deux actifs. Mesure des acides aminés fournit des informations de marquage isotopique environ huit métabolites précurseur crucial dans le métabolisme central. Ces nœuds métaboliques clés peuvent refléter les fonctions des associés voies centrales. 13 Analyse du métabolisme C-assistés par l&#39;intermédiaire protéinogènes acides aminés peuvent être largement utilisés pour la caractérisation fonctionnelle du métabolisme microbien mal caractérisé 1. Dans ce protocole, nous allons utiliser Cyanothece 51142 que la souche modèle pour démontrer l&#39;utilisation de substrats de carbone marqué pour la découverte de nouvelles fonctions enzymatiques.

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Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

13 C-marquage isotopique est une technique utile pour déterminer le métabolisme de la cellule centrale pour divers types de microorganismes. Après les cellules ont été cultivées sur un substrat spécifique marqué, GC-MS de mesure peut révéler des voies métaboliques fonctionnelles basées sur les modèles d&#39;étiquetage unique dans protéinogènes acides aminés.

Confirmation des voies métaboliques et la découverte par 13 C-étiquetage des acides aminés protéinogènes

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine ...

Research

JoVE Journal

Biology

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

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The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

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