Name: metabolic pathway confirmation and discovery through 13c-labeling of proteinogenic amino acids
Uploaded: 2012-01-26T13:00:00
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Diese Studie wurde von einem NSF Career Grant (MCB0954016) und DOE Bioenergy Research Grant (DEFG0208ER64694) unterstützt.

1. Zellkultur (Abbildung 1) <ol><li> Wachsen Zellen in Minimalmedium mit Spurenelemente, Salze, Vitamine und spezifisch markierten Kohlenstoffsubstrate die am besten für Weges Untersuchung. Verwenden Sie entweder Schüttelkolben oder Bioreaktoren für die Zellkultur. Organische Nährstoffe, wie Hefeextrakt, kann mit der Messung von Aminosäure-Kennzeichnung beeinträchtigen und somit nicht anwesend sein kann in dem Kulturmedium. </li><li> Monitor Zellwachstum durch die optische Dichte der Kultur bei einer optimalen W...

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	<li>Zamboni, N., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+biological+insights+through+metabolomics+and+13C-flux+analysis.">Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+analysis+of+microbial+metabolic+fluxes+via+13C+isotopic+labeling.">Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling.</a> Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+carbon+metabolism+in+Dehalococcoides+ethenogenes+strain+195+via+isotopic+and+transcriptomic+analysisa.">Investigation of carbon metabolism in Dehalococcoides ethenogenes strain 195 via isotopic and transcriptomic analysisa.</a> J. Bacteriol. 191, 5224-5231 (2009).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+confirmation+and+flux+analysis+of+central+metabolic+pathways+in+Desulfovibrio+vulgaris+Hildenborough+using+GC-MS+and+FT-ICR+mass+spectrometry.">Pathway confirmation and flux analysis of central metabolic pathways in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough using GC-MS and FT-ICR mass spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 189, 940-949 (2007).</li><li>Dauner, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GC-MS+analysis+of+amino+acids+rapidly+provides+rich+information+for+isotopomer+balancing.">GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing.</a> Biotechnology Progress. 16, 642-649 (2000).</li><li>Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluxome+analysis+using+GC-MS.">Fluxome analysis using GC-MS.</a> Microbial Cell Factories. 6, 6-6 (2007).</li><li>Antoniewicz, M. R., Kelleher, J. K., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+assessment+of+amino+acid+mass+isotopomer+distributions+for+metabolic+flux+analysis.">Accurate assessment of amino acid mass isotopomer distributions for metabolic flux analysis.</a> Anal. Chem. 79, 7554-7559 (2007).</li><li>Wahl, S. A., Dauner, M., Wiechert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+mass+isotopomer+data+evaluation+in+13C+flux+analysis:+mass+isotope+correction,+data+consistency+checking,+and+precursor+relationships.">New tools for mass isotopomer data evaluation in 13C flux analysis: mass isotope correction, data consistency checking, and precursor relationships.</a> Biotechnology and Bioengineering. 85, 259-268 (2004).</li><li>Shaikh, A., Tang, Y. J., Mukhopadhyay, A., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotopomer+distributions+in+amino+acids+from+a+highly+expressed+protein+as+a+proxy+for+those+from+total+protein.">Isotopomer distributions in amino acids from a highly expressed protein as a proxy for those from total protein.</a> Analytical Chemistry. 80, 886-890 (2008).</li><li>Tang, K. -. H., Feng, X., Tang, Y. J., Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+metabolism+and+carbon+fixation+in+Roseobacter+denitrificans+OCh114.">Carbohydrate metabolism and carbon fixation in Roseobacter denitrificans OCh114.</a> PLoS One. 4, e7233-e7233 (2009).</li><li>Tang, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+flow+of+Heliobacterium+modesticaldum+is+more+related+to+Firmicutes+than+to+the+green+sulfur+bacteria.">Carbon flow of Heliobacterium modesticaldum is more related to Firmicutes than to the green sulfur bacteria.</a> J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).</li><li>Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Central+Metabolic+Pathways+in+Thermoanaerobacter+sp.+X514+via+Isotopomer-Assisted+Metabolite+Analysis.">Characterization of the Central Metabolic Pathways in Thermoanaerobacter sp. X514 via Isotopomer-Assisted Metabolite Analysis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 5001-5008 (2009).</li><li>Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixotrophic+and+photoheterotrophic+metabolisms+in+Cyanothece+sp.+ATCC+51142+under+continuous+light.">Mixotrophic and photoheterotrophic metabolisms in Cyanothece sp. ATCC 51142 under continuous light.</a> Microbiology. 156, 2566-2574 (2010).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flux+analysis+of+central+metabolic+pathways+in+Geobacter+metallireducens+during+reduction+of+soluble+Fe(III)-NTA.">Flux analysis of central metabolic pathways in Geobacter metallireducens during reduction of soluble Fe(III)-NTA.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 3859-3864 (2007).</li><li>Tang, Y. J., Meadows, A. L., Kirby, J., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+central+metabolic+pathways+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+reinterpreted+in+the+light+of+isotopic+metabolite+labeling.">Anaerobic central metabolic pathways in Shewanella oneidensis MR-1 reinterpreted in the light of isotopic metabolite labeling.</a> Journal of Bacteriology. 189, 894-901 (2007).</li><li>Zhuang, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+utilization+of+exogenous+amino+acids+by+Dehalococcoides+ethenogenes+strain+195+and+the+enhancement+resulted+to+dechloronation+activity.">Selective utilization of exogenous amino acids by Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and the enhancement resulted to dechloronation activity.</a> Appl. Environ. Microbiol. , (2011).</li><li>Feng, X., Tang, K. -. H., Blankenship, R. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calvin+cycle+flux,+pathway+constraints,+and+substrate+oxidation+state+together+determine+the+H2+biofuel+yield+in+photoheterotrophic+bacteria.">Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria.</a> MBio. 2, (2011).</li><li>Erb, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+C5-dicarboxylic+acids+from+C2-units+involving+crotonyl-CoA+carboxylase/reductase:+The+ethylmalonyl-CoA+pathway.">Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway.</a> PNAS. 104, 10631-10636 (2007).</li><li>Wu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoleucine+synthesis+pathway+in+cyanobacterial+species.">Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species.</a> Microbiology. 156, 596-602 (2010).</li><li>Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unicellular,+aerobic+nitrogen-ï¬xing+cyanobacteria+of+the+genus+Cyanothece.">Unicellular, aerobic nitrogen-ï¬xing cyanobacteria of the genus Cyanothece.</a> J. Bacteriol. 175, 1284-1292 (1993).</li><li>Shastri, A. A., Morgan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+isotopic+labeling+methodology+for+13C+metabolic+flux+analysis+of+photoautotrophic+microorganisms.">A transient isotopic labeling methodology for 13C metabolic flux analysis of photoautotrophic microorganisms.</a> Phytochemistry. 68, 2302-2312 (2007).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariability+of+central+metabolic+flux+distribution+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+under+environmental+or+genetic+perturbations.">Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations.</a> Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).</li><li>Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C-based+metabolic+flux+analysis.">13C-based metabolic flux analysis.</a> Nature Protocols. 4, 878-892 (2009).</li></ol>

Das Protokoll besteht aus Fütterung der Zelle mit einem markierten Substrat und Messung der daraus resultierenden Isotopenmarkierung Muster in den Aminosäuren via GC-MS. Da MS-Daten (m / z-Verhältnisse) nur der Gesamtbetrag der Kennzeichnung von MS-Ionen geben, haben wir auf die Isotopomer Ausschüttungen von Aminosäuren durch die Untersuchung der m / z-Verhältnisse der beiden unfragmentierte (M-57) + und fragmentiert Aminosäuren zu bewerten (dh, (M-159) + und (F302) +). Darüber h...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> TBDMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 19915 </td><td> - </td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34865 </td><td> - </td></tr><tr><td> Labeled Kohlenstoffsubstrat </td><td> Cambridge Isotope Laboratories </td><td> Verlassen Sie sich auf die experimentelle Bedingung </td><td> Website: <a href="http://www.isotope.com">http://www.isotope.com</a> </td></tr><tr><td> Gas-Chromatographen </td><td> Agilent Technologies </td><td> Hewlett-Packard, Modell 7890A </td><td> - </td></tr><tr><td> GC-Säulen </td><td> J &amp; W Scientific, Folsom, CA </td><td> DB5 (30m) </td><td> - </td></tr><tr><td> Massenspektrometer </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5975 </td><td> - </td></tr><tr><td> Reacti-Vap Evaporator </td><td> Thermo Scientific </td><td> TS-18825 </td><td> Zum Trocknen Aminosäure-Proben </td></tr></tbody></table>

metabolic pathway confirmation and discovery through 13c-labeling of proteinogenic amino acids

Mikroben haben komplexe Stoffwechselwege, untersucht mit Hilfe der Biochemie und der funktionellen Genomik Methoden werden kann. Eine wichtige Technik, um Zelle zentralen Stoffwechsel untersuchen und entdecken neue Enzyme ist 13 C-assisted Stoffwechsel-Analyse 1. Diese Technik basiert auf Isotopenmarkierung, wobei Mikroben mit 13 C markierten Substraten zugeführt beruhen. Die Verfolgung der Atom Übergang Wege zwischen Metaboliten in die biochemische Netzwerk können wir bestimmen, funktionale Wege und entdecken neue Enzyme. Als ergänzende Methode zur Transkriptom-und Proteomforschung, Ansätze für Isotopomer-gestützte Analyse von Stoffwechselwegen drei große Schritte 2 enthalten. Erstens, wir wachsen Zellen mit 13 C markierten Substraten. In diesem Schritt werden die Zusammensetzung des Mediums und die Auswahl der markierten Substraten zwei Schlüsselfaktoren. Um zu vermeiden, Mess-Geräusche aus nicht-markierten Kohlenstoffs in Nahrungsergänzungsmittel, Ist ein Minimal-Medium mit einer einzigen Kohlenstoffquelle erforderlich. Weiterhin ist die Wahl einer markierten Substrat, wie effektiv es wird der Weg zu analysierenden Aufklärung basiert. Da neuartige Enzyme beinhalten häufig unterschiedliche Reaktion Stereochemie oder Zwischenprodukte in der Regel einfach markierten Kohlenstoffsubstrate informativer für den Nachweis neuartiger Wege als einheitlich bezeichnet diejenigen für die Erkennung von neuen Bahnen 3, 4 sind. Zweitens analysieren wir Aminosäure Kennzeichnung Muster mit GC -MS. Aminosäuren sind reich an Protein und kann daher aus Biomasse Hydrolyse erhalten werden. Aminosäuren können durch N-(tert-Butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) derivatisiert vor GC-Trennung. TBDMS derivatisierten Aminosäuren kann durch MS und das Ergebnis in verschiedenen Arrays von Fragmenten fragmentiert. Bezogen auf die Masse zu Ladung (m / z)-Verhältnis von fragmentierten und unfragmentierte Aminosäuren, können wir ableiten, die möglichen beschriftet Muster der zentralen Metaboliten, dieVorläufer der Aminosäuren. Drittens verfolgen wir 13C Carbon-Übergänge in der vorgeschlagenen Wege und auf der Grundlage der Isotopomer Daten bestätigen, ob diese Wege Aktiv-2 sind. Messung von Aminosäuren bietet Isotopenmarkierung Informationen rund acht entscheidende Vorstufe Metaboliten in den zentralen Stoffwechsel. Diese metabolischen Schlüssel Knoten spiegeln die Funktionen der assoziierten mittel-Bahnen. 13 C-assisted Stoffwechsel-Analyse über proteinogenen Aminosäuren können sehr für die funktionelle Charakterisierung von schlecht charakterisiert mikrobiellen Stoffwechsel 1 verwendet werden. In diesem Protokoll werden wir Cyanothece 51142 als Modell Belastung verwenden, um die Verwendung markierter Kohlenstoff-Substraten für die Entdeckung neuer enzymatischer Funktionen zu demonstrieren.

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Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

13 C-Isotopenmarkierung ist eine nützliche Technik für die Bestimmung der Zelle zentralen Stoffwechsel für verschiedene Arten von Mikroorganismen. Nachdem die Zellen mit einer bestimmten markiertem Substrat gezüchtet haben, können GC-MS-Messung zeigen funktionale Stoffwechselwege auf einzigartige Kennzeichnung Muster in proteinogenen Aminosäuren basiert.

Stoffwechselweg der Firmung und der Entdeckung durch 13 C-Kennzeichnung von proteinogenen Aminosäuren

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine ...

Research

JoVE Journal

Biology

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

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The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

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