Name: metabolic pathway confirmation and discovery through 13c-labeling of proteinogenic amino acids
Uploaded: 2012-01-26T13:00:00
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この研究は、NSFキャリアグラント（MCB0954016）とDOEバイオエネルギー研究助成（DEFG0208ER64694）によってサポートされていました。

1。細胞培養（図1） <ol><li>微量元素、塩、ビタミン、および経路の調査に最適な特に標識された炭素基質と最少培地で細胞を成長させる。細胞培養用振盪フラスコまたはバイオリアクターのどちらかを使用してください。このような酵母エキスなどの有機栄養素は、アミノ酸の標識の測定に干渉する場合がありますので、培養液中に存在することはできません。 </li><li> UV /可視分光光度計?...

<ol>
	<li>Zamboni, N., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+biological+insights+through+metabolomics+and+13C-flux+analysis.">Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+analysis+of+microbial+metabolic+fluxes+via+13C+isotopic+labeling.">Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling.</a> Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+carbon+metabolism+in+Dehalococcoides+ethenogenes+strain+195+via+isotopic+and+transcriptomic+analysisa.">Investigation of carbon metabolism in Dehalococcoides ethenogenes strain 195 via isotopic and transcriptomic analysisa.</a> J. Bacteriol. 191, 5224-5231 (2009).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+confirmation+and+flux+analysis+of+central+metabolic+pathways+in+Desulfovibrio+vulgaris+Hildenborough+using+GC-MS+and+FT-ICR+mass+spectrometry.">Pathway confirmation and flux analysis of central metabolic pathways in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough using GC-MS and FT-ICR mass spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 189, 940-949 (2007).</li><li>Dauner, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GC-MS+analysis+of+amino+acids+rapidly+provides+rich+information+for+isotopomer+balancing.">GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing.</a> Biotechnology Progress. 16, 642-649 (2000).</li><li>Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluxome+analysis+using+GC-MS.">Fluxome analysis using GC-MS.</a> Microbial Cell Factories. 6, 6-6 (2007).</li><li>Antoniewicz, M. R., Kelleher, J. K., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+assessment+of+amino+acid+mass+isotopomer+distributions+for+metabolic+flux+analysis.">Accurate assessment of amino acid mass isotopomer distributions for metabolic flux analysis.</a> Anal. Chem. 79, 7554-7559 (2007).</li><li>Wahl, S. A., Dauner, M., Wiechert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+mass+isotopomer+data+evaluation+in+13C+flux+analysis:+mass+isotope+correction,+data+consistency+checking,+and+precursor+relationships.">New tools for mass isotopomer data evaluation in 13C flux analysis: mass isotope correction, data consistency checking, and precursor relationships.</a> Biotechnology and Bioengineering. 85, 259-268 (2004).</li><li>Shaikh, A., Tang, Y. J., Mukhopadhyay, A., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotopomer+distributions+in+amino+acids+from+a+highly+expressed+protein+as+a+proxy+for+those+from+total+protein.">Isotopomer distributions in amino acids from a highly expressed protein as a proxy for those from total protein.</a> Analytical Chemistry. 80, 886-890 (2008).</li><li>Tang, K. -. H., Feng, X., Tang, Y. J., Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+metabolism+and+carbon+fixation+in+Roseobacter+denitrificans+OCh114.">Carbohydrate metabolism and carbon fixation in Roseobacter denitrificans OCh114.</a> PLoS One. 4, e7233-e7233 (2009).</li><li>Tang, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+flow+of+Heliobacterium+modesticaldum+is+more+related+to+Firmicutes+than+to+the+green+sulfur+bacteria.">Carbon flow of Heliobacterium modesticaldum is more related to Firmicutes than to the green sulfur bacteria.</a> J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).</li><li>Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Central+Metabolic+Pathways+in+Thermoanaerobacter+sp.+X514+via+Isotopomer-Assisted+Metabolite+Analysis.">Characterization of the Central Metabolic Pathways in Thermoanaerobacter sp. X514 via Isotopomer-Assisted Metabolite Analysis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 5001-5008 (2009).</li><li>Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixotrophic+and+photoheterotrophic+metabolisms+in+Cyanothece+sp.+ATCC+51142+under+continuous+light.">Mixotrophic and photoheterotrophic metabolisms in Cyanothece sp. ATCC 51142 under continuous light.</a> Microbiology. 156, 2566-2574 (2010).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flux+analysis+of+central+metabolic+pathways+in+Geobacter+metallireducens+during+reduction+of+soluble+Fe(III)-NTA.">Flux analysis of central metabolic pathways in Geobacter metallireducens during reduction of soluble Fe(III)-NTA.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 3859-3864 (2007).</li><li>Tang, Y. J., Meadows, A. L., Kirby, J., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+central+metabolic+pathways+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+reinterpreted+in+the+light+of+isotopic+metabolite+labeling.">Anaerobic central metabolic pathways in Shewanella oneidensis MR-1 reinterpreted in the light of isotopic metabolite labeling.</a> Journal of Bacteriology. 189, 894-901 (2007).</li><li>Zhuang, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+utilization+of+exogenous+amino+acids+by+Dehalococcoides+ethenogenes+strain+195+and+the+enhancement+resulted+to+dechloronation+activity.">Selective utilization of exogenous amino acids by Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and the enhancement resulted to dechloronation activity.</a> Appl. Environ. Microbiol. , (2011).</li><li>Feng, X., Tang, K. -. H., Blankenship, R. E., Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+flux+analysis+of+the+mixotrophic+metabolisms+in+the+green+sulfur+bacterium+Chlorobaculum+tepidum.">Metabolic flux analysis of the mixotrophic metabolisms in the green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum.</a> J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).</li><li>McKinlay, J. B., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+dioxide+fixation+as+a+central+redox+cofactor+recycling+mechanism+in+bacteria.">Carbon dioxide fixation as a central redox cofactor recycling mechanism in bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).</li><li>McKinlay, J. B., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calvin+cycle+flux,+pathway+constraints,+and+substrate+oxidation+state+together+determine+the+H2+biofuel+yield+in+photoheterotrophic+bacteria.">Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria.</a> MBio. 2, (2011).</li><li>Erb, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+C5-dicarboxylic+acids+from+C2-units+involving+crotonyl-CoA+carboxylase/reductase:+The+ethylmalonyl-CoA+pathway.">Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway.</a> PNAS. 104, 10631-10636 (2007).</li><li>Wu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoleucine+synthesis+pathway+in+cyanobacterial+species.">Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species.</a> Microbiology. 156, 596-602 (2010).</li><li>Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unicellular,+aerobic+nitrogen-ï¬xing+cyanobacteria+of+the+genus+Cyanothece.">Unicellular, aerobic nitrogen-ï¬xing cyanobacteria of the genus Cyanothece.</a> J. Bacteriol. 175, 1284-1292 (1993).</li><li>Shastri, A. A., Morgan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+isotopic+labeling+methodology+for+13C+metabolic+flux+analysis+of+photoautotrophic+microorganisms.">A transient isotopic labeling methodology for 13C metabolic flux analysis of photoautotrophic microorganisms.</a> Phytochemistry. 68, 2302-2312 (2007).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariability+of+central+metabolic+flux+distribution+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+under+environmental+or+genetic+perturbations.">Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations.</a> Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).</li><li>Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C-based+metabolic+flux+analysis.">13C-based metabolic flux analysis.</a> Nature Protocols. 4, 878-892 (2009).</li></ol>

このプロトコルは、標識基質を細胞に供給し、GC - MSを経由してアミノ酸に生じる同位体標識パターンを測定することで構成されています。 MSデータ（m / zの比）がちょうどMSイオンのラベリングの全体的な量を与えるので、我々は両方の断片化されていないのm / zの比（M - 57）+を調べて、断片化されたアミノ酸でアミノ酸のアイソトポマーの分布を評価する必要があります（?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> TBDMS </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 19915 </td><td> - </td></tr><tr><td> THF </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 34865 </td><td> - </td></tr><tr><td>標識された炭素基板</td><td>ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ</td><td>実験的な要件に依存する</td><td>ウェブサイト： <a href="http://www.isotope.com">http://www.isotope.com</a> </td></tr><tr><td>ガスクロマトグラフ</td><td>アジレントテクノロジー</td><td> Hewlett - Packard社、モデル7890A </td><td> - </td></tr><tr><td> GCカラム </td><td> J＆Wサイエンティフィック、フォルサム、カリフォルニア州</td><td> DB5（30メートル） </td><td> - </td></tr><tr><td>質量分析計</td><td>アジレントテクノロジー</td><td> 5975C </td><td> - </td></tr><tr><td>アクティ-バップEvaporator </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> TS - 18825 </td><td>アミノ酸試料を乾燥するための</td></tr></tbody></table>

metabolic pathway confirmation and discovery through 13c-labeling of proteinogenic amino acids

微生物は、生化学と機能ゲノミクス手法を用いて検討することができる複雑な代謝経路を持っている。セル中央の代謝を検討し、新しい酵素を発見する一つの重要な技術は、13 C -アシスト代謝の分析1です。この手法は、微生物が13 C標識基質が供給されるという同位体標識に基づいています。生化学ネットワークにおける代謝物との間の原子の遷移パスをトレースすることで、我々は機能的な経路を決定し、新しい酵素を発見することができます。 トランスクリプトミクスとプロテオミクスを補完する方法としては、代謝経路のアイソトポマー支援分析のためのアプローチは3つの主要手順2を含んでいます。 まず 、我々は13 C標識基質と細胞を成長させる。このステップでは、培地の組成および標識基質の選択は2つの重要な要因です。栄養補助食品の非標識炭素から測定ノイズを避けるために、唯一の炭素源と最少培地が必要です。さらに、標識された基質の選択は、それが分析されている経路を解明する方法を効果的に基づいています。小説の酵素は、しばしば別の反応の立体化学や中間製品を含むので、一般的に、単独で標識された炭素の基質は、新規の経路3,4の検出のための均一標識したものよりも小説の経路を検出するための、より有益である。 第二 ​​に 、我々は、GCを使用して、アミノ酸の標識パターンを分析する- MS。アミノ酸は、タンパク質が豊富ですので、バイオマスの加水分解から得ることができる。アミノ酸は、GCの分離の前にN -（tert -ブチルジメチルシリル）- N - methyltrifluoroacetamide（TBDMS）で誘導体化することができる。 TBDMS誘導体化アミノ酸は、MSとのフラグメントの異なる配列の結果によって分割されることがあります。断片化と断片化されていないアミノ酸の電荷（m / z）比質量に基づいて、我々は、中央代謝の可能性というラベルの付いたパターンを推測することができますアミノ酸の前駆体。 第三に 、我々はこれらの経路が2アクティブであるかどうかを確認、アイソトポマーのデータに基づいて、提案された経路で13C炭素の遷移をトレースします。アミノ酸の測定は、中央代謝八重要な前駆体の代謝物に関する同位体標識の情報を提供します。これらの代謝キーのノードは、関連付けられている中心的な経路の機能を反映することができます。 タンパク質構成アミノ酸を介した13 C -アシスト代謝分析は広く特徴のあまりない微生物代謝1の機能解析に使用することができます。このプロトコルでは、我々は新たな酵素機能を発見するためのラベルの付いた炭素基質の使用方法を示すためのモデル株としてCyanothece 51142を使用します。

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Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

13 C -同位体標識は、微生物の様々なタイプの細胞の中央代謝を決定するための便利なテクニックです。細胞が特異的な標識基質で培養された後、GC - MS測定では、タンパク質構成アミノ酸のユニークな標識パターンに基づいて、機能的な代謝経路を明らかにすることができます。

スルー代謝経路の確認と発見 13</supタンパク質構成アミノ酸の> C標識

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine ...

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