Name: live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix
Uploaded: 2011-12-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix at JoVE.com

Wij danken dr. Grant Sumida voor de kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een Beckman Young Investigator Award (SY), een Hellman Family New Faculty Award (SY), een NIH EUREKA, de University of California Cancer Research Coordinating Committee.

1. Het genereren van een stabiele cellijn (bijv. MDCK cellen) <ol><li> Plaat cellen op 80-90% confluentie in een p35 schotel. Laat geen cellen vormen 100% confluent monolaag, die transfectie-efficiëntie zal verminderen. </li><li> Transfecteren de cellen met het plasmide van belang met behulp van Lipofectamine 2000. Optimaliseren transfectie omstandigheden met behulp van de fabrikant protocol. </li><li> De volgende dag, passage van de cellen in twee P150 petrischaaltjes. De grote schaal wordt aanbevolen om voldoende a...

<ol>
	<li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration.">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li><li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures.">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li><li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry.">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modeling approaches to in vivo imaging.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">Fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li></ol>

Hier beschrijven we een methode voor het gebruik van live-cell imaging om de mechanismen van de cel migratie onderzoek in een drie-dimensionale matrix. Het succes van deze techniek is afhankelijk van het verkrijgen van &quot;goede&quot; klonen stabiel uiten van GFP-gelabelde eiwitten. Het lage niveau van GFP eiwitten vergt een teveel excitatie blootstelling die cel gezondheid van compromissen, terwijl een te hoge GFP niveau hebben ongewenste neveneffecten op de cel. Zo is de vector keuze om genen in cellen te transfecte...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Collageen, runderen, Type I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354231 </td><td> Voorraad is ongeveer 3 mg / ml </td></tr><tr><td> 3-aminopropyltrimethoxysilaan </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 281778 </td><td> Verdunnen in water </td></tr><tr><td> glutaraldehyde </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 340855 </td><td> Verdund in PBS </td></tr><tr><td> 1M Hepes </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Fluospheres polystyreen microsferen een micrometer, rode fluorescentie (580/605) </td><td> Invitrogen </td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticine (G418) </td><td> Invitrogen </td><td> 11811-031 </td><td></td></tr&gt; <tr><td colspan="4"> Cultuur media componenten: </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal Bovine Serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix

Traditioneel is celmigratie onderzocht op twee-dimensionale, stijve kunststof oppervlakken. Echter, tijdens belangrijke biologische processen zoals wondgenezing, weefselregeneratie en kanker metastase, moeten cellen navigeren door complexe, driedimensionale extracellulaire weefsel. Om beter te begrijpen van de mechanismen achter deze biologische processen, is het belangrijk te onderzoeken of het rollen van de eiwitten die verantwoordelijk zijn voor het rijden celmigratie. Hier schetsen we een protocol om de mechanismen van celmigratie het gebruik van de epitheel cellijn (MDCK) te bestuderen, en een drie-dimensionale, vezelig, self-polymeriseren matrix als een modelsysteem. Dit optisch heldere extracellulaire matrix is ​​lastig om live-cell imaging studies en een betere bootst de fysiologische, weke delen omgeving. Dit rapport toont een techniek voor het direct visualiseren eiwit lokalisatie en dynamiek, en de vervorming van de omringende drie-dimensionale matrix. Tentamenzoek van eiwit lokalisatie en dynamiek tijdens de cellulaire processen biedt belangrijke inzicht in de eiwit-functies. Genetisch gecodeerd fluorescerende labels bieden een unieke methode voor de waarneming eiwit lokalisatie en dynamiek. Met deze techniek kunnen we de subcellulaire accumulatie van de belangrijkste te analyseren, kracht-genererende cytoskelet componenten in real-time als de cel manoeuvres door de matrix. Daarnaast is het gebruik van meerdere fluorescerende labels met verschillende golflengten, kunnen we de lokalisatie van meerdere eiwitten tegelijk, waardoor we, test bijvoorbeeld of verschillende eiwitten gelijkaardige of uiteenlopende rollen. Bovendien kan de dynamiek van fluorescent gelabelde eiwitten worden gekwantificeerd aan de hand Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analyse. Deze meting assays het eiwit mobiliteit en hoe stabiel de eiwitten gebonden zijn aan het cytoskelet-netwerk. Door de combinatie van live-cell imaging met de behandeling van eiwit functie-remmers,kunnen we nagaan in real-time de veranderingen in de verdeling van eiwitten en de morfologie van migrerende cellen. Verder hebben we ook combineren live-cell imaging met het gebruik van fluorescerende tracer deeltjes ingebed in de matrix van de matrix vervorming te visualiseren tijdens de celmigratie. Zo kunnen we visualiseren hoe een migrerende cel kracht-genererende eiwitten verdeelt, en waar de trekkrachten worden uitgeoefend met de omringende matrix. Door middel van deze technieken, kunnen we waardevol inzicht te krijgen in de rol van specifieke eiwitten en hun bijdragen aan de mechanismen van de cel migratie.

Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix at JoVE.com

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Cellulaire processen zoals celmigratie van oudsher bestudeerd op twee-dimensionale, stijve kunststof oppervlakken. Dit rapport beschrijft een techniek voor het direct visualiseren eiwit lokalisatie en het analyseren van eiwitten dynamiek in cellen migreren in een meer fysiologisch relevante, drie-dimensionale matrix.

Live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Drie-dimensionale Optische resolutie Fotoakoestisch Microscopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Vlakke en Three-Dimensional Printing van geleidende inkten

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universal Hand-held Driedimensionale opto-akoestische Imaging Probe voor Deep Tissue Human-angiografie en Functional preklinisch Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse van cel-migratie binnen Driedimensionale Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Met behulp van Cell-substraat Impedantie en live cell imaging naar Real-time veranderingen in de cellulaire adhesie en De-adhesie geïnduceerd door Matrix Wijziging Meet

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Genereren van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent en Automated Verwonden

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Live cell imaging tijdens Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Techniek Driedimensionale epitheelweefsels Embedded binnen extracellulaire matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Electrospinning schrijven van driedimensionale Poly(ε-caprolactone) steigers met controleerbare Morphologies voor Tissue Engineering toepassingen smelten

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Kweken van zoogdiercellen in driedimensionale Peptide steigers

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...