Name: live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix
Uploaded: 2011-12-22T13:00:00
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Nous remercions le Dr Grant Sumida pour une lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par une bourse de jeune chercheur Beckman (SY), une famille Hellman Faculté nouveau prix (SY), un EUREKA NIH, l&#39;Université de Californie recherche sur le cancer comité de coordination.

1. Génération d&#39;une lignée cellulaire stable (par exemple des cellules MDCK) <ol><li> Cellules de la plaque à 80-90% de confluence dans un plat à p35. Ne laissez pas les cellules sous forme de 100% monocouche confluente, ce qui réduira l&#39;efficacité de la transfection. </li><li> Transfecter les cellules avec le plasmide d&#39;intérêt en utilisant Lipofectamine 2000. Optimiser les conditions de transfection utilisant le protocole du fabricant. </li><li> Le lendemain, le passage des cellules dans deux bo...

<ol>
	<li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration.">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li><li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures.">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li><li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry.">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modeling approaches to in vivo imaging.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">Fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li></ol>

Nous décrivons ici une méthode pour utiliser imagerie des cellules vivantes pour étudier les mécanismes de la migration de cellules dans une matrice tridimensionnelle. Le succès de cette technique dépend de l&#39;obtention de &quot;bons&quot; clones exprimant de façon stable la GFP-tagged protéines. Le faible niveau de protéines GFP, il faudra une exposition d&#39;excitation en excès qui compromet la santé des cellules, alors que le niveau trop élevé GFP aura des effets secondaires indésirables sur la cell...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Collagène, bovins, de type I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354231 </td><td> Stock est d&#39;environ 3 mg / ml </td></tr><tr><td> 3-aminopropyltriméthoxysilane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 281778 </td><td> Diluer dans de l&#39;eau </td></tr><tr><td> glutaraldéhyde </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 340855 </td><td> Diluer dans du PBS </td></tr><tr><td> Hepes 1M </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Polystyrène Fluospheres microsphères 1 pm, fluorescence rouge (580/605) </td><td> Invitrogen </td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td> Généticine (G418) </td><td> Invitrogen </td><td> 11811-031 </td><td></td></tr&gt; <tr><td colspan="4"> Culture composantes médias: </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix

Traditionnellement, la migration cellulaire a été étudié sur deux dimensions, les surfaces en plastique rigide. Toutefois, au cours des processus biologiques importants tels que la cicatrisation des plaies, la régénération des tissus, et les métastases du cancer, les cellules doivent naviguer à travers complexe, en trois dimensions du tissu extracellulaire. Afin de mieux comprendre les mécanismes derrière ces processus biologiques, il est important d&#39;examiner les rôles des protéines responsables de la conduite de migration cellulaire. Ici, nous présentons un protocole d&#39;étudier les mécanismes de la migration cellulaire en utilisant la lignée cellulaire épithéliale (MDCK), et un en trois dimensions, fibreuse, autopolymérisant matrice comme un système modèle. Cette matrice extracellulaire est optiquement clair facilement s&#39;adapter à des études d&#39;imagerie des cellules vivantes et mieux imite le physiologiques, l&#39;environnement des tissus mous. Ce rapport démontre une technique pour visualiser directement la localisation des protéines et la dynamique, et la déformation de la entourant matrice tridimensionnelle. Exammination de la localisation des protéines et la dynamique des processus cellulaires au cours donne un aperçu de la clé dans les fonctions des protéines. Génétiquement codés étiquettes fluorescentes offrent une méthode unique pour l&#39;observation de la localisation des protéines et de dynamique. En utilisant cette technique, nous pouvons analyser l&#39;accumulation intracellulaire de la clé, la force génératrice de composants du cytosquelette en temps réel que les manœuvres des cellules à travers la matrice. De plus, en utilisant de multiples balises fluorescentes avec différentes longueurs d&#39;onde, nous pouvons examiner la localisation de protéines multiples simultanément, nous permettant ainsi de tester, par exemple, si différentes protéines ont des rôles similaires ou divergents. Par ailleurs, la dynamique des protéines par fluorescence marqués peuvent être quantifiés à l&#39;aide de récupération fluorescent après photoblanchiment (FRAP) analyse. Cette mesure de la mobilité des dosages des protéines et comment stablement lié les protéines sont sur le réseau du cytosquelette. En combinant imagerie des cellules vivantes avec le traitement des inhibiteurs de la fonction des protéines,nous pouvons examiner en temps réel l&#39;évolution de la répartition des protéines et la morphologie des cellules migrantes. Par ailleurs, nous aussi combiner imagerie des cellules vivantes avec l&#39;utilisation de particules de traceur fluorescent incorporé dans la matrice pour visualiser la déformation de matrice lors de la migration cellulaire. Ainsi, nous pouvons visualiser comment une cellule migration distribue la force génératrice de protéines, et où les forces de traction sont exercées à la matrice environnante. Grâce à ces techniques, nous pouvons avoir un aperçu précieux sur les rôles des protéines spécifiques et de leurs contributions aux mécanismes de la migration cellulaire.

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Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Processus cellulaires tels que la migration des cellules ont traditionnellement été étudié sur deux dimensions, les surfaces en plastique rigide. Ce rapport décrit une technique pour visualiser directement la localisation des protéines et l&#39;analyse de la dynamique des protéines dans les cellules de migrer dans un plus physiologiquement pertinents, en trois dimensions de la matrice.

Imagerie des cellules vivantes des cellules exprimant des protéines par fluorescence Migration-étiquetés dans une matrice tridimensionnelle

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tridimensionnelle optique résolution microscopie photoacoustique

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Recherche

Bio-ingénierie

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Impression Planar et en trois dimensions des encres conductrices

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universal à main en trois dimensions optoacoustique sonde d&#39;imagerie pour Deep Tissue angiographie humain et des études précliniques fonctionnels en temps réel

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse de la migration cellulaire dans un tridimensionnelle Matrice Collagène

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Utilisant une impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et De-adhérence induites par Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Génération d&#39;une épaisseur en trois dimensions équivalent de peau et automatisé Blessant

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Imagerie sur cellule vivante pendant stretch mécanique

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Ingénierie en trois dimensions des tissus épithéliaux incorporés au sein de la matrice extracellulaire

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Faire fondre électrofilage écrit d’échafaudages Poly(ε-caprolactone) en trois dimensions avec des Morphologies contrôlables pour les Applications de génie tissulaire

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Culture de cellules mammifères dans les échafaudages de Peptide en trois dimensions

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...