Name: live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix
Uploaded: 2011-12-22T13:00:00
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Wir danken Dr. Grant Sumida für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch einen Beckman Young Investigator Award (SY), ein Hellman Familie New Faculty Award (SY), ein NIH EUREKA, die University of California Cancer Research Coordinating Committee unterstützt.

1. Generierung von stabilen Zelllinien (zB MDCK-Zellen) <ol><li> Platte Zellen bei 80-90% Konfluenz in einer p35 Gericht. Lassen Sie sich nicht Zellen bilden 100% konfluenten Monolayer, die Transfektionseffizienz verringern. </li><li> Schleusen die Zellen mit dem Plasmid von Interesse mit Lipofectamine 2000. Optimieren Transfektionsbedingungen mit dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Am nächsten Tag, Passage der Zellen in zwei p150 Petrischalen. Die große Schüssel wird empfohlen, genügend Abstand zwischen den ...

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	<li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration.">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li><li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures.">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li><li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry.">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modeling approaches to in vivo imaging.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">Fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li></ol>

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Verwendung live-cell imaging, die Mechanismen der Zellwanderung in einer dreidimensionalen Matrix zu studieren. Der Erfolg dieses Verfahrens hängt von den Erhalt &quot;gut&quot; Klone stabil exprimieren GFP-markierten Proteine. Das niedrige Niveau der GFP-Proteine ​​erfordert einen Überschuss Anregung Exposition der Zelle Gesundheit Kompromisse, während ein zu hoher GFP Ebene unerwünschte Nebenwirkungen auf die Zelle haben wird. Somit ist der Vektor Wahl, um Gene in Zellen ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Collagen, Rinder-, Typ-I- </td><td> BD Biosciences </td><td> 354231 </td><td> Stock ist ca. 3 mg / ml </td></tr><tr><td> 3-Aminopropyltrimethoxysilan </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 281778 </td><td> Verdünnen in Wasser </td></tr><tr><td> Glutaraldehyd </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 340855 </td><td> Verdünnen Sie in PBS </td></tr><tr><td> 1M Hepes </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Fluospheres Polystyrol-Mikrokügelchen 1 um, rote Fluoreszenz (580/605) </td><td> Invitrogen </td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticin (G418) </td><td> Invitrogen </td><td> 11811-031 </td><td></td></tr&gt; <tr><td colspan="4"> Kultur Media-Komponenten: </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix

Traditionell wurde die Zellwanderung auf zweidimensionalen, steife Kunststoff-Oberflächen untersucht. Doch bei wichtigen biologischen Prozessen wie der Wundheilung, Geweberegeneration und Krebs Metastasen, müssen die Zellen durch komplexe, dreidimensionale extrazelluläre Gewebe zu navigieren. Zum besseren Verständnis der Mechanismen hinter diesen biologischen Prozessen ist es wichtig, die Rolle der Proteine ​​verantwortlich für den Antrieb Zellmigration zu untersuchen. Hier skizzieren wir ein Protokoll, um die Mechanismen der Zell-Migration mit der epithelialen Zelllinie (MDCK)-Studie, und eine dreidimensionale, faserig, Selbst-Polymerisation von Matrix als Modellsystem. Diese optisch klare extrazellulären Matrix ist leicht zugänglich live-cell imaging Studien und besser imitiert die physiologische, Weichteil-Umgebung. Dieser Bericht zeigt eine Technik für die direkte Visualisierung von Protein-Lokalisierung und Dynamik, und die Verformung des umgebenden dreidimensionalen Matrix. PrüfungEliminierung von Protein-Lokalisierung und Dynamik bei zellulären Prozessen bietet wichtige Einblicke in Protein-Funktionen. Genetisch kodierte fluoreszierende Tags bieten eine einzigartige Methode zur Beobachtung Proteinlokalisierung und Dynamik. Mit dieser Technik können wir die subzelluläre Ansammlung von Schlüssel zu analysieren, Kraft generierenden Komponenten des Zytoskeletts in Echtzeit, wie die Zelle Manöver durch die Matrix. Darüber hinaus mit mehreren fluoreszierenden Markierungen mit unterschiedlichen Wellenlängen, können wir die Ortung von mehreren Proteinen gleichzeitig, so dass wir zu testen, zum Beispiel, ob unterschiedliche Proteine ​​ähnliche oder unterschiedliche Rollen haben. Darüber hinaus kann die Dynamik der Fluoreszenz-markierten Proteinen quantifiziert unter Verwendung von fluoreszierenden Recovery After Photobleaching (FRAP) Analyse sein. Diese Messung Assays das Protein Mobilität und wie stabil gebunden werden die Proteine, die Zytoskelett-Netzwerks. Durch die Kombination von live-cell imaging mit der Behandlung von Protein-Funktion Inhibitoren,Wir können in Echtzeit die Änderungen in der Verteilung der Proteine ​​und die Morphologie der wandernden Zellen zu untersuchen. Darüber hinaus kombinieren wir auch live-cell imaging mit der Verwendung von fluoreszierenden Tracer-Partikel in der Matrix eingebettet werden, um die Matrix Verformung während der Zellmigration zu visualisieren. So können wir visualisieren, wie eine wandernde Zelle krafterzeugenden Proteine ​​verteilt, und wo die Zugkräfte auf die umgebende Matrix ausgeübt. Durch diese Techniken können wir wertvolle Einblicke in die Rolle von spezifischen Proteinen und ihre Beiträge zu den Mechanismen der Zellwanderung zu gewinnen.

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Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Zellulären Prozessen wie Zellmigration haben sich traditionell auf zweidimensionale, steifen Kunststoff-Oberflächen untersucht. Dieser Bericht beschreibt eine Technik zur direkten Visualisierung von Protein-Lokalisierung und Analyse von Protein-Dynamik in Zellen wandern in eine physiologisch relevante, dreidimensionale Matrix.

Live-Cell-Imaging von wandernden Zellen mit dem Ausdruck Fluoreszenz-markierten Proteinen in einer dreidimensionalen Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Forschung

Biotechnik

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Planar-und Drei-Dimensional Printing von Leitfähige Druckfarben

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universal-Hand Dreidimensionale Optoakustische Bildgebung Sonde für Deep Tissue Menschen Angiographie und Funktions präklinischen Studien in Echtzeit

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse der Zellmigration in eine dreidimensionale Kollagenmatrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Live Cell Imaging bei Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Elektrospinnen Schreiben von dreidimensionalen Poly(ε-caprolactone) Gerüste mit steuerbaren Morphologien für Tissue Engineering Anwendungen zu schmelzen

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Kultivierung von Säugerzellen in dreidimensionale Peptid Gerüste

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...