Name: live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix
Uploaded: 2011-12-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix at JoVE.com

אנו מודים לד&quot;ר גרנט סאמידה לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי פרס החוקר הצעיר Beckman (ש&quot;י), משפחה חדשה הלמן הפקולטה פרס (ש&quot;י), EUREKA-NIH, מאוניברסיטת קליפורניה לחקר הסרטן ועדת התיאום.

1. הדור של שורת תאים יציבה (תאים MDCK למשל) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים ב 80-90% confluency בצלחת P35. אל תתנו תאים טופס monolayer ומחוברות 100%, אשר תפחית את יעילות transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect תאים עם פלסמיד עניין באמצעות Lipofectamine 2000. מטב התנאי?...

<ol>
	<li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration.">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li><li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures.">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li><li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry.">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modeling approaches to in vivo imaging.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">Fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li></ol>

כאן אנו מתארים שיטה לשימוש לחיות תאים הדמיה ללמוד את המכניזם של נדידת תאים במטריצה ​​תלת מימדי. ההצלחה של טכניקה זו תלויה בהשגת &quot;טוב&quot; שיבוטים ביציבות להביע GFP-tagged חלבונים. רמה נמוכה של חלבון ה-GFP ידרוש חשיפה עירור עודף פשרות בריאות התא, ואילו רמה גבוהה מדי של GFP יה...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> קולגן, שור, סוג I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354231 </td><td> מלאי הוא כ 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 3-aminopropyltrimethoxysilane </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> 281778 </td><td> מדולל במים </td></tr><tr><td> glutaraldehyde </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> 340855 </td><td> מדולל ב PBS </td></tr><tr><td> 1M Hepes </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Fluospheres פוליסטירן microspheres 1 מיקרומטר, אדום פלואורסצנטי (580/605) </td><td> Invitrogen </td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticin (G418) </td><td> Invitrogen </td><td> 11811-031 </td><td></td></tr&gt; <tr><td colspan="4"> תרבות התקשורת מרכיבים: </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td> סרום שור עוברית </td><td> אטלנטה הביולוגיים </td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix

באופן מסורתי, נדידת תאים נחקרה על דו מימדי, משטחי פלסטיק נוקשה. עם זאת, במהלך תהליכים ביולוגיים חשובים כגון ריפוי פצעים, התחדשות רקמות, גרורות סרטן, התאים חייבים לנווט רקמות מורכבות תלת ממדי, תאית. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים מאחורי אלה תהליכים ביולוגיים, חשוב לבחון את תפקידם של החלבונים האחראיים על נהיגה נדידת תאים. כאן, אנו מתאר פרוטוקול ללמוד את המכניזם של נדידת תאים באמצעות שורת תאים אפיתל (MDCK), וכן תלת ממדי, סיבי, עצמית polymerizing מטריקס כמערכת מודל. זה תאי מטריקס ברור אופטית ניתנת בקלות לחיות תאים לימודי הדמיה טוב יותר מחקה את הסביבה הפיזיולוגית, רקמות רכות. דו&quot;ח זה מדגים טכניקה ישירות חזותי לוקליזציה חלבון דינמיקה, ו דפורמציה של מטריקס תלת ממדי שמסביב. בחינהביעור לוקליזציה של חלבונים ודינמיקה במהלך תהליכים תאיים מספק תובנה מפתח לתוך פונקציות חלבון. תגי פלורסנט מקודדים גנטית לספק שיטה ייחודית התבוננות לוקליזציה חלבון ודינמיקה. באמצעות טכניקה זו, אנו יכולים לנתח את הצטברות subcellular של מפתח, כוח להפקת רכיבים cytoskeletal בזמן אמת כמו תמרונים התא באמצעות המטריצה. בנוסף, באמצעות תגי פלורסנט עם מספר אורכי גל שונים, אנו יכולים לבחון את לוקליזציה של חלבונים רבים בו זמנית, ובכך מאפשר לנו לבחון, למשל, אם חלבונים שונים יש תפקידים דומים או מסתעף. יתר על כן, הדינמיקה של החלבונים המתויגים fluorescently ניתן לכמת באמצעות שחזור פלורסנט לאחר photobleaching (FRAP) ניתוח. זה מבחני המדידה ניידות חלבון ואיך קשור ביציבות החלבונים הם לרשת cytoskeletal. על ידי שילוב של תאים חיים הדמיה בטיפול של מעכבי תפקוד החלבון,אנו יכולים לבחון בזמן אמת את השינויים בהתפלגות של חלבונים מורפולוגיה של תאים נודדים. יתר על כן, אנו משלבים גם לחיות תאים הדמיה עם שימוש של חלקיקים נותב פלורסנט מוטבע בתוך המטריצה ​​כדי להמחיש את העיוות מטריקס במהלך נדידת תאים. לפיכך, אנו יכולים לדמיין כיצד תא נודדות מפיצה כוח להפקת חלבונים, שבו כוחות המתיחה הם הפעילו את המטריצה ​​שמסביב. באמצעות טכניקות אלה, אנו יכולים לקבל תובנה חשובה התפקידים של חלבונים ספציפיים תרומתם המנגנונים של נדידת תאים.

Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix at JoVE.com

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

תהליכים תאיים כגון נדידת תאים מסורתי נחקרו על דו מימדי, משטחי פלסטיק נוקשה. דו&quot;ח זה מתאר טכניקה ישירות חזותי לוקליזציה חלבון וניתוח הדינמיקה חלבון בתאי נודדות בתוך מטריצה ​​יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית תלת מימדי,.

Live-תא הדמיה של תאים מעבר הבעת חלבונים fluorescently-מתויג מטריקס תלת מימדי

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

הדפסה מישוריים תלת ממדי של דיו מוליך

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

יוניברסל כף היד תלת ממדי Optoacoustic הדמיה בדיקה לרקמות עמוקות אנגיוגרפיה אדם ופונקציונליים פרה-קליניים מחקרים בזמן אמת

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

שימוש בעכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי כדי למדוד שינויים בזמן אמת בסלולרית הידבקות ודה-הידבקות הנגרמים על ידי מטריקס שינוי

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

דור של עור בעובי מלא תלת ממדי Equivalent ואוטומטי פציעה

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

הדמיה של תא חי במהלך מכאני למתוח

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

להמיס Electrospinning הכתיבה של פיגומים Poly(ε-caprolactone) תלת מימדי עם מורפולוגיות לשליטה עבור יישומי הנדסת רקמות

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...