Name: live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix
Uploaded: 2011-12-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix at JoVE.com

Ringraziamo il dottor Grant Sumida per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da un Premio Giovani Investigator Beckman (SY), una famiglia Hellman New Faculty Award (SY), EUREKA NIH, l&#39;Università della California Cancer Research Coordinating Committee.

1. Generazione di linee cellulari stabili (per esempio cellule MDCK) <ol><li> Cellule di germi a 80-90% confluenza in un piatto p35. Non lasciate che le cellule forma al 100% monostrato confluenti, che ridurrà l&#39;efficienza di trasfezione. </li><li> Trasfezione delle cellule con il plasmide di interesse utilizzando Lipofectamine 2000. Ottimizzare le condizioni di transfezione utilizzando il protocollo del produttore. </li><li> Il giorno dopo, il passaggio delle cellule in due p150 piastre Petri. Il grande piatto ?...

<ol>
	<li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration.">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li><li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures.">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li><li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry.">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modeling approaches to in vivo imaging.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">Fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li></ol>

Qui si descrive un metodo per l&#39;utilizzo live-cell imaging per studiare i meccanismi di migrazione delle cellule in una matrice tridimensionale. Il successo di questa tecnica dipende da ottenere &quot;buoni&quot; cloni che esprimono stabilmente GFP-tagged proteine. Il basso livello di proteine ​​GFP richiede un&#39;esposizione eccesso di eccitazione che compromette la salute delle cellule, mentre il livello troppo alto GFP avrà effetti collaterali indesiderati sulla cellula. Così, la scelta vettore per trasfet...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Collagene, bovino, tipo I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354231 </td><td> Magazzino è di circa 3 mg / ml </td></tr><tr><td> 3-aminopropyltrimethoxysilane </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 281778 </td><td> Diluire in acqua </td></tr><tr><td> glutaraldeide </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 340855 </td><td> Diluire in PBS </td></tr><tr><td> Hepes 1M </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Fluospheres polistirolo microsfere di 1 micron, fluorescenza rossa (580/605) </td><td> Invitrogen </td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticin (G418) </td><td> Invitrogen </td><td> 11811-031 </td><td></td></tr&gt; <tr><td colspan="4"> Cultura dei media componenti: </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td> Siero bovino fetale </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix

Tradizionalmente, la migrazione delle cellule è stato studiato su due dimensioni, superfici in plastica rigida. Tuttavia, durante importanti processi biologici come la guarigione delle ferite, la rigenerazione dei tessuti, e le metastasi del cancro, le cellule devono navigare attraverso complesse, tridimensionali tessuto extracellulare. Per meglio comprendere i meccanismi alla base di questi processi biologici, è importante esaminare il ruolo delle proteine ​​responsabili per la guida migrazione cellulare. Qui, delineare un protocollo per studiare i meccanismi della migrazione cellulare utilizzando la linea delle cellule epiteliali (MDCK) e una tridimensionale, fibroso, auto-polimerizzazione della matrice come sistema modello. Questa matrice extracellulare otticamente chiaro è facilmente riconducibile a vivere a cellule studi di imaging e meglio imita il fisiologico, l&#39;ambiente dei tessuti molli. Questa relazione dimostra una tecnica per la visualizzazione diretta di localizzazione delle proteine ​​e la dinamica, e la deformazione del circostante matrice tridimensionale. Esameminazione della localizzazione delle proteine ​​e delle dinamiche durante i processi cellulari fornisce informazioni chiave in funzioni delle proteine. Geneticamente codificato tag fluorescenti di fornire un metodo unico per osservare la localizzazione delle proteine ​​e la dinamica. Utilizzando questa tecnica, possiamo analizzare l&#39;accumulo subcellulare di chiave, la forza che generano componenti del citoscheletro in tempo reale come le manovre cellula attraverso la matrice. Inoltre, utilizzando più tag fluorescenti con diverse lunghezze d&#39;onda, possiamo esaminare la localizzazione delle proteine ​​contemporaneamente, permettendoci così di prova, ad esempio, se diverse proteine ​​hanno ruoli simili o divergenti. Inoltre, la dinamica delle proteine ​​fluorescenti tag può essere quantificata l&#39;utilizzo di recupero dopo photobleaching fluorescenti (FRAP) analisi. Questo test misura la mobilità delle proteine ​​e come stabilmente le proteine ​​sono legati alla rete del citoscheletro. Grazie alla combinazione di live-cellulare imaging con trattamento di inibitori della funzione della proteina,possiamo esaminare in tempo reale i cambiamenti nella distribuzione delle proteine ​​e della morfologia delle cellule migrano. Inoltre, abbiamo anche combinare live-cell imaging con l&#39;uso di particelle traccianti fluorescenti incorporate nella matrice di visualizzare la matrice di deformazione durante la migrazione cellulare. Quindi, possiamo visualizzare come una cellula migrazione distribuisce la forza che generano le proteine, e dove le forze di trazione sono esercitate alla matrice circostante. Attraverso queste tecniche, siamo in grado di acquisire una conoscenza diretta dei ruoli delle proteine ​​specifiche e il loro contributo ai meccanismi della migrazione cellulare.

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Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Processi cellulari come la migrazione delle cellule sono stati tradizionalmente studiati su due dimensioni, superfici in plastica rigida. Questo rapporto descrive una tecnica per la visualizzazione diretta di localizzazione delle proteine ​​e l&#39;analisi dinamica della proteina in cellule di migrare in modo più fisiologicamente rilevanti, matrice tridimensionale.

Live-cellula Imaging di migrazione delle cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti-taggato in una matrice tridimensionale

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

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Live-cellula Imaging di migrazione delle cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti-taggato in una matrice tridimensionale

Live-cellula Imaging di migrazione delle cellule che esprimono proteine fluorescenti-taggato in una matrice tridimensionale