Name: live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix
Uploaded: 2011-12-22T13:00:00
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私たちは、原稿の重要な読書のためにグラント博士隅田川に感謝。この作品は、ベックマン若手研究者賞（SY）、ヘルマンファミリー新学部賞（SY）、NIH EUREKA、カリフォルニア州がん研究調整委員会の大学によってサポートされていました。

1。安定細胞株の生成（例：MDCK細胞） <ol><li> p35の皿でコンフルエント80から90パーセントで、細胞をプレート。細胞はトランスフェクション効率を減少させるが100％コンフルエントな単層を形成させてはいけません。 </li><li>リポフェクトアミン2000を用いて目的のプラスミドで細胞をトランスフェクション。製造業者のプロトコルを使用してトランスフェクション条件を最適化する。 </li><li>...

<ol>
	<li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration.">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li><li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures.">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li><li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry.">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modeling approaches to in vivo imaging.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">Fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li></ol>

ここでは、三次元マトリックスに細胞移動のメカニズムを研究するために生きた細胞のイメージングを使用するための方法を説明します。この手法の成功は、安定的にGFPタグ融合タンパク質を発現している&quot;良い&quot;のクローンを得ることに依存する。 GFPタンパク質の低レベルが高すぎるGFPのレベルは、セル上で望ましくない副作用を持っているが、細胞の健康を損なう過剰な励起の露出...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>コラーゲンは、ウシ、タイプI </td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 354231 </td><td>株価は3 mg / mlの約</td></tr><tr><td> 3 - アミノプロピルトリメトキシシラン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 281778 </td><td>水で薄める</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 340855 </td><td> PBSで希釈し</td></tr><tr><td> 1M Hepes緩衝</td><td>インビトロジェン</td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Fluospheresのポリスチレン微小球を1μm、赤色蛍光（605分の580） </td><td>インビトロジェン</td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td>ジェネティシン（G418） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11811-031 </td><td></td></TR&gt; <tr><td colspan="4"> 文化メディアコンポーネント： </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>アトランタバイオ</td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix

伝統的に、細胞の遊走は、二次元、硬いプラスチックの表面に研究されている。しかし、このような創傷治癒、組織再生、および癌の転移などの重要な生物学的プロセスの間に、細胞は複雑な、三次元細胞組織をナビゲートする必要があります。よりよいこれらの生物学的プロセスの背後にあるメカニズムを理解するには、細胞移動を駆動するための責任蛋白質の役割を調べることが重要です。ここで、我々は、上皮細胞株を（MDCK）を使用して細胞移動のメカニズムを研究するためのプロトコルの概要を説明し、モデルシステムとして、三次元、繊維、自己重合行列。この光学的に透明な細胞外マトリックスは、生細胞イメージング研究に容易に適していると良いの生理的、軟組織の環境を模倣しています。このレポートは、直接タンパク質の局在や動態を可視化するためのテクニック、そして周囲の三次元マトリックスの変形を示しています。 試験細胞プロセス中のタンパク質の局在とダイナミクスの追うものは、タンパク質の機能に重要な洞察を提供します。遺伝的に符号化された蛍光標識は、タンパク質の局在や動態を観察するためのユニークな方法を提供する。このテクニックを使用して、我々は、マトリックスを介して細胞の操縦に、リアルタイムで細胞骨格成分の力が、生成、鍵の細胞内蓄積を分析することができます。さらに、波長の異なる複数の蛍光タグを用いて、我々はこのように私たちは別のタンパク質が類似または発散の役割を持っているかどうか、例えば、テストすることが、同時に複数のタンパク質の局在を調べることができます。さらに、蛍光標識タンパク質のダイナミクスは（FRAP）解析を光退色後蛍光回復を使用して定量することができる。この測定アッセイ蛋白質の機動性とどのように安定的に結合したタンパク質は細胞骨格ネットワークになる。 タンパク質機能阻害剤の治療でライブセルイメージングを組み合わせることで、我々は、タンパク質と移行する細胞の形態の分布のリアルタイムの変化で調べることができます。さらに、我々はまた、細胞移動中に行列の変形を可視化するマトリックス内に埋め込まれた蛍光トレーサー粒子の使用による生きた細胞のイメージングを組み合わせる。従って、我々は移行細胞が力を生み出すタンパク質の配布方法可視化することができます、そしてどこに牽引力が周囲のマトリックスに発揮されています。これらの技術を通じ、我々は、特定のタンパク質と細胞移動のメカニズムへの貢献の役割に貴重な洞察を得ることができます。

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Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

このような細胞遊走などの細胞プロセスは伝統的に二次元、硬いプラスチックの表面に研究されている。このレポートは、直接タンパク質の局在を可視化し、より生理学的に関連する、三次元マトリックスに移行する細胞で蛋白質のダイナミクスを分析するためのテクニックを説明します。

三次元マトリックスの蛍光タグ付きタンパク質を発現する遊走細胞の生細胞イメージング

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

三次元光学分解能光音響顕微鏡

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

導電性インクの平面および三次元印刷

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

ディープティシュ人間血管造影および機能前臨床研究のためのユニバーサルハンドヘルド三次元光音響イメージングプローブリアルタイムで

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

マトリックス修飾により誘導される細胞接着及び脱接着におけるリアルタイムの変化を測定するために、細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージングを使用して、

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

三次元の全層皮膚等価物と自動傷つけ処理の発生

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

細胞外マトリックス内に埋め込まれたエンジニアリング三次元上皮組織

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

組織工学的応用の制御可能な形態の三次元 Poly(ε-caprolactone) 足場のエレクトロスピニング記述を溶かす

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

三次元ペプチド足場で哺乳動物の細胞を培養

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...