Name: live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix
Uploaded: 2011-12-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix at JoVE.com

Vi takker Dr. Grant Sumida for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av en Beckman Young Investigator Award (SY), en Hellman Familie New fakultet Award (SY), en NIH EUREKA, University of California Cancer Research Coordinating Committee.

1. Generering av stabil cellelinje (f.eks MDCK celler) <ol><li> Plate celler på 80-90% confluency i en P35 parabolen. Ikke la cellene danner 100% confluent monolayer, noe som vil redusere transfeksjon effektivitet. </li><li> Transfektere cellene med plasmidet av interesse å bruke Lipofectamine 2000. Optimaliser transfeksjon forhold ved hjelp av produsentens protokollen. </li><li> Neste dag, passasje cellene i to P150 petriskåler. Den store parabolen er anbefalt å tillate nok avstanden mellom stallen koloniene. </l...

<ol>
	<li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration.">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li><li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures.">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li><li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry.">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modeling approaches to in vivo imaging.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">Fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li></ol>

Her beskriver vi en metode for å bruke live-cell imaging for å studere mekanismer for celle migrasjon i en tre-dimensjonal matrise. Suksessen med denne teknikken er avhengig av å få &quot;gode&quot; kloner stabilt uttrykker GFP-merket proteiner. Det lave nivået av GFP proteiner vil kreve en egenandel eksitasjon eksponering som kompromisser celle helse, mens for høy GFP nivå vil ha uønskede bivirkninger på cellen. Dermed er vektoren valg å transfektere gener i celler viktig (f.eks promoter, fluorescens tag, etc...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Kollagen, storfe, type I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354231 </td><td> Stock er ca 3 mg / ml </td></tr><tr><td> 3-aminopropyltrimethoxysilane </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 281778 </td><td> Tynnes i vann </td></tr><tr><td> glutaraldehyd </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 340855 </td><td> Fortynn i PBS </td></tr><tr><td> 1M Hepes </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Fluospheres isopor mikrosfærer 1 mikrometer, rød fluorescens (580/605) </td><td> Invitrogen </td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticin (G418) </td><td> Invitrogen </td><td> 11811-031 </td><td></td></tr&gt; <tr><td colspan="4"> Kultur media komponenter: </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix

Tradisjonelt har celle migrasjon blitt studert på to-dimensjonale, stiv plast overflater. Men under viktige biologiske prosesser som sårtilheling, vev gjenfødelse, og kreft metastasering, må cellene navigere gjennom komplekse, tre-dimensjonale ekstracellulære vev. For bedre å forstå mekanismene bak disse biologiske prosesser er det viktig å undersøke rollene av proteiner ansvarlig for kjøring celle migrasjon. Her skissere vi en protokoll for å studere mekanismer for celle migrasjon bruke epithelial cellelinje (MDCK), og en tre-dimensjonal, fibrøs, self-polymerizing matrix som modell system. Dette optisk klart ekstracellulær matrix er lett mottagelig for live-cell imaging studier og bedre etterligner de fysiologiske, bløtvev miljø. Denne rapporten viser en teknikk for direkte visualisere protein lokalisering og dynamikk, og deformasjon av de omkringliggende tre-dimensjonal matrise. Eksamenination av protein lokalisering og dynamikk i cellulære prosesser gir viktig innsikt i protein funksjoner. Genetisk kodet fluorescerende tagger gir en unik metode for å observere protein lokalisering og dynamikk. Ved hjelp av denne teknikken, kan vi analysere subcellular opphopning av nøkkelen, force-generering cytoskeletal komponenter i real-tid som cellen manøvrer gjennom matrisen. I tillegg bruker flere fluorescerende tagger med forskjellige bølgelengder, kan vi undersøke lokalisering av flere proteiner samtidig, dermed tillater oss å teste, for eksempel om ulike proteiner har samme eller forskjellige roller. Videre kan dynamikken av fluorescensmerket tagget proteiner kvantifiseres ved hjelp av fluoriserende Recovery Etter fotobleking (FRAP) analyse. Denne målingen analyser av protein mobilitet og hvordan stabilt bundet proteinene er til cytoskeletal nettverk. Ved å kombinere live-cell imaging med behandling av protein funksjon hemmere,vi kan undersøke i sanntid endringer i fordelingen av proteiner og morfologi trekkende celler. Videre har vi også kombinere live-cell imaging med bruk av fluorescerende tracer partikler innebygd i matrisen å visualisere matrisen deformasjon under celle migrasjon. Dermed kan vi se hvordan en trekkende celle distribuerer kraft-genererende proteiner, og hvor traction kreftene utøves til den omkringliggende matrisen. Gjennom disse teknikkene kan vi få verdifull innsikt i rollene til spesifikke proteiner og deres bidrag til mekanismer for celle migrasjon.

Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix at JoVE.com

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Cellulære prosesser som celle migrasjon har tradisjonelt blitt studert på to-dimensjonale, stiv plast overflater. Denne rapporten beskriver en teknikk for direkte visualisere protein lokalisering og analyse av protein dynamikk i celler migrere i en mer fysiologisk relevant, tre-dimensjonal matrise.

Live-cell Imaging of Migrering cellene uttrykker fluorescensmerket-merket Proteiner i en tredimensjonal Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Planar og tredimensjonale Trykking av Conductive blekk

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universal Håndholdt Tredimensjonal Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Menneskelig angiografi og Funksjonell prekliniske studier i Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse av celle migrasjon innenfor en tre-dimensjonal Kollagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Ved hjelp av Cell-substrat Impedans og Live Cell Imaging å måle sanntid Endringer i Cellular Grep og De-adhesjon indusert av Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generering av en Tredimensjonal Full Tykkelse hudekvivalent og Automated såret

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Live-Cell Imaging under Mekanisk Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Engineering Tredimensjonal epitelvev innebygd i ekstracellulær matriks

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Smelt Electrospinning skriving av tredimensjonale Poly(ε-caprolactone) stillaser med kontrollerbar Morphologies for Tissue Engineering programmer

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Dyrking pattedyrceller i tredimensjonale peptid stillaser

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...