Name: live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix
Uploaded: 2011-12-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix at JoVE.com

Мы благодарим доктора Гранта Сумида за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана Бекман премия для молодых следователь (SY), семьи Hellman Новая премия факультета (SY), NIH EUREKA, Калифорнийский университет онкологический научный координационный комитет.

1. Генерация стабильной клеточной линии (например, MDCK клеток) <ol><li> Пластина клеток на 80-90% слияния в p35 блюдо. Не позволяйте клетки образуют 100% сливающийся монослой, что снизит эффективность трансфекции. </li><li> Трансфекции клеток с плазмидой интерес использованием Lipofectamine 2000 года. Оптими?...

<ol>
	<li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration.">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li><li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures.">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li><li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry.">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modeling approaches to in vivo imaging.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">Fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li></ol>

Здесь мы опишем метод с использованием живых клеток изображений для изучения механизмов миграции клеток в трехмерной матрице. Успех этого метода зависит от получения &quot;хорошего&quot; клонов стабильно выразить GFP с метками белков. Низкий уровень белков GFP потребуется чрезмерное воздейс...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> Коллаген, крупного рогатого скота, тип I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354231 </td><td> Питание патронами около 3 мг / мл </td></tr><tr><td> 3-aminopropyltrimethoxysilane </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 281778 </td><td> Развести в воде </td></tr><tr><td> глутаральдегида </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 340855 </td><td> Развести в ФСБ </td></tr><tr><td> 1M Hepes </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Fluospheres полистирола микросфер 1 мкм, красная флуоресценция (580/605) </td><td> Invitrogen </td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td> Генетицин (G418) </td><td> Invitrogen </td><td> 11811-031 </td><td></td></TR&gt; <tr><td colspan="4"> Культура СМИ компоненты: </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td> Эмбриональной бычьей сыворотки </td><td> Атланты биологические препараты </td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td> Пенициллина / стрептомицина </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Канамицин </td><td> Invitrogen </td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix

Традиционно, миграции клеток изучалась на двумерных, жесткие пластмассовые поверхности. Тем не менее, во время важных биологических процессов, таких как заживление ран, регенерации тканей, метастазирования и рака, клетки должны ориентироваться в сложной, трехмерной внеклеточной ткани. Чтобы лучше понять механизмы, лежащие в этих биологических процессов, важно для изучения роли белков, ответственных за вождение миграции клеток. Здесь мы опишем протокол для изучения механизмов клеточной миграции с использованием эпителиальных клеточных линий (MDCK), и трехмерные, волокнистых, само-полимеризации матрицы в качестве модельной системы. Это оптически прозрачные внеклеточного матрикса легко поддаются живых клеток исследования изображений и лучше имитирует физиологическую, мягких тканей среды. Данный отчет демонстрирует технику для визуализации непосредственно локализации белка и динамики, и деформации окружающей трехмерной матрицы. Экзаменination локализации белка и динамики в процессе клеточных процессов обеспечивает понимание ключевых белков функций. Генетически закодированный флуоресцентные метки обеспечивают уникальный метод для наблюдения локализации белка и динамики. Используя эту технику, мы можем проанализировать субклеточных накопления ключ, сила генерирующих компонентов цитоскелета, в режиме реального времени, как клетка маневров через матрицу. Кроме того, использование нескольких флуоресцентных меток с разными длинами волн, мы можем рассмотреть локализацию нескольких белков одновременно, что позволяет нам проверить, например, могут ли различные белки имеют сходные или различные роли. Кроме того, динамика флуоресцентно меткой белки могут быть количественно, используя флуоресцентные Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) анализа. Это измерение анализов подвижности белка и как стабильно связаны белки цитоскелета в сети. Объединив жить-клеточной визуализации при лечении ингибиторами функции белка,мы можем рассмотреть в режиме реального времени изменения в распределении белков и морфологии мигрирующих клеток. Кроме того, мы и объединяем в живых клеток изображений с использованием флуоресцентных частиц трассирующими встроены в матрицу для визуализации матрицы деформации в процессе миграции клеток. Таким образом, мы можем представить себе, как мигрирующие ячейки распределяет силу генерирующих протеины, и где тяги силы оказываемого на окружающую матрицу. С помощью этих методов, мы можем получить ценную информацию о роли специфических белков и их вклад в механизмы клеточной миграции.

Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix at JoVE.com

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Клеточных процессов, таких как сотовые миграции традиционно изучался на двумерных, жесткие пластмассовые поверхности. В настоящем докладе описывается методика визуализации белка непосредственно локализации и анализа динамики белков в клетках, мигрирующих в физиологически более актуальной, трехмерные матрицы.

Live-ячейки изображения по переносу клеток, экспрессирующих флуоресцентно с метками Белки в трехмерной матрице

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Трехмерная оптическая разрешением Фотоакустическая микроскопии

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Плоские и трехмерной печати проводящей краски

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Универсальный ручной трехмерной оптико-акустической визуализации зонд для Deep Tissue человека ангиографии и функциональных доклинических исследований в режиме реального времени

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Анализ миграции клеток в трехмерном коллагеновой матрице

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Использование Cell-субстрата сопротивление и живых изображений сотовый измерить в реальном времени изменения в клеточной адгезии и Де адгезии, индуцированной Matrix модификации

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Генерация трехмерной всю толщину кожи Эквивалент техники и автоматизированных Ранение

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Живых изображений сотовый процессе механической Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Инженерная Трехмерные эпителиальной ткани Встроенные в внеклеточной матрицы

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Расплава Electrospinning написания трехмерных Poly(ε-caprolactone) леса с контролируемым морфологии тканей инженерных приложений

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Культивирование клеток млекопитающих в трехмерной пептид подмости

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...