Name: live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix
Uploaded: 2011-12-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix at JoVE.com

Vi tackar Dr Grant Sumida för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöds av en Beckman Young Investigator Award (SY), ett Hellman Familj ny fakultet Award (SY), en NIH Eureka, University of California Cancer Research samordningskommitté.

1. Generering av stabil cell linje (t.ex. MDCK celler) <ol><li> Tavla celler vid 80-90% confluency i ett P35 maträtt. Låt inte cellerna bildar 100% konfluenta cellslager, vilket kommer att minska transfektion effektivitet. </li><li> Transfektera cellerna med hjälp av plasmiden av intresse att använda Lipofectamine 2000. Optimera transfektion villkor med tillverkarens protokoll. </li><li> Nästa dag, passage de celler i två P150 petriskålar. Den stora skålen rekommenderas att låta tillräckligt avstånd mellan ...

<ol>
	<li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration.">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li><li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures.">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li><li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry.">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modeling approaches to in vivo imaging.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">Fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li></ol>

Här beskriver vi en metod för att använda live-cell imaging för att studera de mekanismer av cell migration i en tredimensionell matris. Framgången för denna teknik är beroende av att få &quot;bra&quot; kloner stabilt uttrycka GFP-märkta proteiner. Den låga GFP proteiner kommer att kräva ett överskott excitation exponering som kompromisser cell hälsa, medan för hög GFP nivå kommer att få oönskade biverkningar på cellen. Således är vektorn val att transfektera gener i celler viktiga (t.ex., promotorn...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Kollagen, nötkreatur, typ I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354.231 </td><td> Stock är ca 3 mg / ml </td></tr><tr><td> 3-aminopropyltrimethoxysilane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 281.778 </td><td> Späd med vatten </td></tr><tr><td> glutaraldehyd </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 340.855 </td><td> Späd i PBS </td></tr><tr><td> 1M Hepes </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Fluospheres polystyren mikrosfärer 1 mikrometer, röd fluorescens (580/605) </td><td> Invitrogen </td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticin (G418) </td><td> Invitrogen </td><td> 11811-031 </td><td></td></tr&gt; <tr><td colspan="4"> Kultur medier komponenter: </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td> Fetalt bovinserum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix

Traditionellt har cell migration studerats på två-dimensionell, styv plast ytor. Men under viktiga biologiska processer som sårläkning, vävnadsregenerering och cancer metastaser, celler navigera genom komplexa, tredimensionella extracellulära vävnaden. För att bättre förstå mekanismerna bakom dessa biologiska processer är det viktigt att undersöka vilken roll de proteiner ansvarar för att driva cell migration. Vi presenterar här ett protokoll för att studera mekanismer för cell migration med hjälp av epitelceller linje (MDCK) och en tre-dimensionell, fibrösa, själv-polymerisation matris som modellsystem. Detta optiskt klar extracellulära matrisen är lätta att live-cell imaging studier och bättre efterliknar fysiologiska, mjukdelar miljö. Denna rapport visar en teknik för att direkt visualisera protein lokalisering och dynamik, och deformering av den omgivande tredimensionella matris. Examnering av protein lokalisering och dynamik under cellulära processer ger viktig inblick i protein funktioner. Genetiskt kodade fluorescerande taggar ge en unik metod för att observation protein lokalisering och dynamik. Med denna teknik kan vi analysera subcellulära ansamling av nyckel, kraft-genererande cytoskelettala komponenter i realtid som cellen manövrar genom matrisen. Dessutom använder flera fluorescerande taggar med olika våglängder, kan vi undersöka lokalisering av flera proteiner samtidigt, vilket gör det möjligt för oss att testa, till exempel om olika proteiner har liknande eller olika roller. Dessutom kan dynamiken i fluorescerande taggade proteiner kvantifieras med hjälp av fluorescerande återhämtning efter fotoblekning (FRAP) analys. Denna mätning analyser proteinet rörlighet och hur stabilt bundna till proteiner till cytoskelettala nätverk. Genom att kombinera live-cell imaging med behandling av inhibitorer proteiners funktion,kan vi undersöka i realtid på förändringar i fördelningen av proteiner och morfologi av flyttande celler. Dessutom kombinerar vi också live-cell imaging med hjälp av fluorescerande spårämne partiklar inbäddade i matrisen för att visualisera matrisen deformation vid cell migration. Därmed kan vi visualisera hur en vandrande cell distribuerar kraft-genererande proteiner och där dragkrafter är utövas till den omgivande matris. Genom dessa metoder kan vi få värdefull insikt i de rollerna av specifika proteiner och deras bidrag till mekanismer för cell migration.

Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix at JoVE.com

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Cellulära processer såsom cell migration har traditionellt studerats på två-dimensionell, styv plast ytor. Denna rapport beskriver en teknik för att direkt visualisera protein lokalisering och analys av proteiner dynamik i celler vandrar i ett mer fysiologiskt relevant tredimensionell matris.

Live-cell imaging att migrera celler som uttrycker fluorescerande-taggade proteiner i en tredimensionell matris

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tredimensionell optisk upplösning photoacoustic Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Plana och tredimensionella Tryckning av ledande bläck

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Universal Handhållna Tredimensionell optoakustisk Imaging Probe för djup vävnad Human angiografi och funktionella Prekliniska studier i realtid

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analys av Cell Migration inom en tredimensionell kollagenmatris

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Använda Cell-substrat Impedans och levande cell imaging att mäta Realtids Förändringar i Cellular Adhesion och De-vidhäftning inducerad av Matrix Ändring

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generering av ett tredimensionellt Full Tjocklek hudekvivalent och automatiserade sårar

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Levande cell imaging under mekanisk Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Engineering Tredimensionella epitelvävnader Embedded inom extracellulär matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Smälta Electrospinning handstil av tredimensionella Poly(ε-caprolactone) ställningar med kontrollerbar morfologier för Tissue Engineering program

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Odling däggdjursceller i tredimensionella peptid ställningar

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...