Name: live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix
Uploaded: 2011-12-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix at JoVE.com

Biz yazının eleştirel okuma Dr. Grant Sumida teşekkür ederim. Bu çalışma, Beckman Genç Araştırmacı Ödülü (SY), Hellman Aile Yeni Fakülte Ödülü (SY), NIH EUREKA, University of California Kanser Araştırma Koordinasyon Komitesi tarafından desteklenmiştir.

1. Istikrarlı hücre hattı oluşturma (örneğin MDCK hücreleri) <ol><li> P35 çanak confluency% 80-90 Plaka hücreleri. Hücrelerin transfeksiyon verimliliği azaltacaktır% 100 konfluent tek tabaka oluşturur izin vermeyin. </li><li> Lipofectamine 2000 kullanarak ilgi plazmid hücreleri Transfect. Transfeksiyon koşulları üreticinin protokolü kullanılarak optimize edin. </li><li> Ertesi gün, geçit, iki P150 petri kutularının içine hücreler. Büyük bir çanak stabil kolonileri arasında yeterince boşlu...

<ol>
	<li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration.">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li><li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures.">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li><li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry.">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modeling approaches to in vivo imaging.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">Fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li></ol>

Burada, üç boyutlu bir matris hücre göçü mekanizmaları çalışma canlı hücre görüntüleme kullanmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu tekniğin başarı stably GFP-etiketli proteinlerin ifade &quot;iyi&quot; klonlar elde bağlıdır. GFP proteinlerin düşük seviyesi çok yüksek, GFP seviyesi hücrede istenmeyen yan etkileri var ise, hücre sağlığını tehlikeye atar aşırı uyarım pozlama gerektirir. Böylece, hücre içine genler transfect vektör seçim (örneğin, organizatörü, floresan e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Kollajen, sığır, Tip I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354231 </td><td> Stok 3 mg / ml </td></tr><tr><td> 3-aminopropyltrimethoxysilane </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 281778 </td><td> Suda sulandırınız </td></tr><tr><td> glutaraldehid </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 340855 </td><td> PBS içinde seyreltin </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Fluospheres polistiren mikroküreler 1 mikron, kırmızı floresans (580/605) </td><td> Invitrogen </td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticin (G418) </td><td> Invitrogen </td><td> 11811-031 </td><td></td></tr&gt; <tr><td colspan="4"> Kültür medya bileşenleri: </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Atlanta Biyolojik </td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix

Geleneksel olarak, hücre göçü, iki boyutlu, sert plastik yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Ancak, yara iyileşmesi, doku rejenerasyonu ve kanser metastazı gibi önemli biyolojik süreçleri sırasında, hücrelerin karmaşık, üç boyutlu ekstrasellüler doku ile dolaşmak gerekir. Bu biyolojik süreçlerin altında yatan mekanizmaları daha iyi anlamak için, hücre göçü sürüş için sorumlu proteinlerin rollerini incelemek için önemlidir. Burada, epitel hücre hattı (MDCK) kullanarak hücre göç mekanizmaları incelemek için bir protokol taslağı, ve üç boyutlu bir model sistem olarak, lifli, kendi kendine polimerize matris. Bu optik net ekstraselüler matriks, canlı hücre görüntüleme çalışmaları kolayca mükellef ve fizyolojik, yumuşak doku ortamı daha iyi taklit eder. Bu rapor doğrudan protein yerelleştirme ve dinamikleri görselleştirmek için tekniği ve çevresindeki üç boyutlu matris deformasyon gösterir. Sınavhücresel süreçleri sırasında protein yerelleştirme ve dinamikleri ination protein fonksiyonları önemli bir fikir verir. Genetik olarak kodlanmış olan floresan etiketleri protein yerelleştirme ve dinamikleri gözlemlemek için benzersiz bir yöntem sağlar. Bu tekniği kullanarak, anahtar hücre içi birikimi analiz edebilir, kuvvet üreten matris yoluyla hücre manevraları gibi gerçek zamanlı sitoskeletal bileşenleri. Buna ek olarak, farklı dalga boylarına sahip birden fazla floresan etiketlerini kullanarak, biz, böylece bize farklı proteinler benzer veya birbirinden farklı rollere sahip olup olmadığını, örneğin, test etmek için izin proteinlerin aynı anda birden fazla lokalizasyonu inceleyebilirsiniz. Ayrıca, floresan tagged proteinleri (sıkı bağlamak) analizi Photobleaching sonra Floresan Recovery programını kullanarak dinamikleri belirlenebilir. Bu ölçüm testleri, protein hareketlilik ve nasıl stably proteinler bağlı iskelet ağ. Canlı hücre görüntüleme protein fonksiyonu inhibitörlerinin tedavi ile birleştirerek,proteinleri ve göç eden hücrelerin morfolojisi dağıtım gerçek zamanlı değişiklikleri inceleyebilirsiniz. Ayrıca, biz de hücre göçü sırasında matris deformasyon görselleştirmek için matris içinde gömülü floresan tracer parçacıkların kullanımı ile canlı hücre görüntüleme birleştirir. Böylece, kuvvet üreten bir göç hücre proteinleri nasıl dağıttığını görselleştirmek, nerede ve çekiş güçleri çevreleyen matriks sarf edilir. Bu teknikler sayesinde, hücre göçü mekanizmaları spesifik proteinlerin ve onların katkılarını rolleri içine değerli bilgiler elde edebilirsiniz.

Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix at JoVE.com

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Hücre göçü gibi hücresel süreçleri, geleneksel iki boyutlu, sert plastik yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Bu rapor doğrudan protein lokalizasyon görselleştirme ve daha fizyolojik ilgili üç boyutlu bir matris içinde göç eden hücrelerin protein dinamiklerini analiz etmek için bir teknik anlatılmaktadır.

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

İletken Mürekkepler düzlemsel ve Üç Boyutlu Baskı

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

Evrensel Real Time Derin Doku İnsan Anjiografi ve Fonksiyonel Preklinik Çalışmalar üç boyutlu Optoacoustic Görüntüleme Probe El

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Matrix Modifikasyon Bağlı Hücresel Yapışma ve De-yapışma Real-time Değişiklikleri Tedbir Hücre-substrat Empedans ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Mekanik Stretch sırasında Canlı Hücre Görüntüleme

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Üç boyutlu Poly(ε-caprolactone) İskele kontrol edilebilir türleri morfoloji ile Electrospinning yazma doku mühendisliği uygulamaları için erime

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...