Name: paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the drosophila melanogaster giant fiber system
Uploaded: 2012-04-15T14:00:00
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Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Mari eo laboratório Godenschwege, em especial Aline Yonezawa, para comentários e ajudar com este protocolo. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame R21NS06637 concessão para FM e TAG; AB foi financiado pelo número prêmio National Science Foundation 082925, URM: Biologia Integrativa para futuros pesquisadores.

1. Eletrofisiologia Rig Set-up <ol><li> O equipamento necessário para o equipamento de electrofisiologia de configuração é descrito em detalhe por Augustin et ai. neste Jornal 14. Por favor, consulte este artigo para uma explicação detalhada dos aparatos necessários eletrofisiológicas. </li><li> Modifique o descrito anteriormente eletrofisiologia plataforma set-up 14 por adição de um micromanipulador sexta, que detém a nanoinjector. Para um fácil acesso para a cabeça do anim...

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	<li>Koehn, F. E., Carter, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+role+of+natural+products+in+drug+discovery.">The evolving role of natural products in drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 4, 206-220 (2005).</li><li>Miljanich, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ziconotide:+neuronal+calcium+channel+blocker+for+treating+severe+chronic+pain.">Ziconotide: neuronal calcium channel blocker for treating severe chronic pain.</a> Curr. Med. Chem. 11, 3029-3040 (2004).</li><li>Layer, R. T., Wagstaff, J. D., White, H. 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Neurosci. 28, 587-597 (2008).</li></ol>

O bioensaio nanoinjection / eletrofisiologia aqui apresentada permite uma rápida triagem de compostos no sistema nervoso da mosca da fruta. Este é um novo na técnica in vivo que requer pequenas quantidades de um composto para eliciar um efeito sobre uma variedade de alvos moleculares em um circuito bem caracterizado neuronal. Este método pode ser usado para testar a bioactividade de compostos diferentes, a partir de toxinas desconhecidos para comercialmente disponíveis agentes farmacológicos. </p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Gravação de eletrodos de vidro: vidro borosilicato capilares </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> 1B100F-4 </td><td> 1,0 milímetros OD, 0,58 milímetro ID </td></tr><tr><td> Estimulador </td><td> Grass Instruments </td><td> Modelo S48 </td><td></td></tr><tr><td> Amplificador </td><td> Obtendo Instruments Inc. </td><td> 5A modelo </td><td></td></tr><tr><td> Aquisição de dados Software: Digidata </td><td> Molecular Devices </td><td> Modelo 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Dados software de coleta: pCLAMP </td><td> Molecular Devices </td><td> Versão 10 </td><td></td></tr><tr><td> Estereomicroscópio wom fibra óptica iluminador anel microscópio </td><td> AmScope </td><td> SM-4T Modelo HL250-AR </td><td></td></tr><tr><td> Dissecando espaço para montagem </td><td> AmScope </td><td> SM-2TZ </td><td></td></tr><tr><td> Kite micromanipulador Manual &amp; Inclinação da Base </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> Modelo # M3301 Kite: Modelo # KITE-M3-L </td><td></td></tr><tr><td> Drosophila melanogaster Selvagem genótipo 10E (cepa selvagem) </td><td> Bloomington estoque centro </td><td> Stock # 3892 </td><td></td></tr><tr><td> Vertical pipeta extrator </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Modelo 700c </td><td></td></tr><tr><td> Injeção micropipetas de vidro: vidro borosilicato capilares </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> Catálogo # 4878 </td&gt; <td> OD 1,14 milímetros, 0,5 milímetros ID </td></tr><tr><td> Óleo de silicone </td><td> Pescador </td><td> Catálogo # S159-500 </td><td></td></tr><tr><td> Beveler </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> KT Tipo Brown Modelo # BV-10 </td><td></td></tr><tr><td> Nanoliter2000 </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> Catálogo # B203XVY </td><td></td></tr><tr><td> Corante azul </td><td> McCormick </td><td> N / A </td><td> Ingredientes: água, propileno glicol, FD &amp; C Azul 1, e 0,1% Propilparabeno (conservante). </td></tr><tr><td> Methyllycaconitine citrato (MLA) </td><td> Tocris Bioscience </td><td> Catálogo # 1029 </td><td></td></tr><tr><td> Plástico paus de cera </td><td> Hygenic Corporation (Akron Ohio EUA) </td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table>

paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the drosophila melanogaster giant fiber system

Os compostos de rastreio para a actividade in vivo pode ser usada como um primeiro passo para identificar candidatos que podem ser desenvolvidos em 1,2 agentes farmacológicos. Nós desenvolvemos uma nova ensaio nanoinjection / electrofisiologia que permite a detecção de efeitos modulatórios bioactivos de compostos sobre a função de um circuito neuronal que medeia a resposta de fuga em Drosophila melanogaster 3,4. O nosso ensaio in vivo, que utiliza o sistema de fibra de Drosophila gigante (GFS, Figura 1) permite a triagem de diferentes tipos de compostos, tais como pequenas moléculas ou péptidos, e requer apenas quantidades mínimas de eliciar um efeito. Além disso, a Drosophila GFS oferece uma grande variedade de potenciais alvos moleculares nos neurônios ou músculos. As fibras gigantes (FG) sinapse electricamente (Junções Gap), bem como quimicamente (colinérgica) sobre uma sinapse periférica Interneuron (PSI) e do músculo tergo Trochanteral neurónio (TTMn) 5 </sup&gt;. O PSI para DLMn conexão (neurônio muscular longitudinal dorsal) é dependente Dα7 receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) 6. Finalmente, a junção neuromuscular (JNM) do TTMn eo DLMn com o salto (TTM) e os músculos de vôo (DLM) são glutamatérgica 7-12. Aqui, é mostrado como para injectar quantidades nanolitros de um composto, enquanto que a obtenção de electrofisiológicos gravações intracelulares a partir do sistema de fibra gigante 13 e como para monitorizar os efeitos do composto sobre a função deste circuito. Nós mostramos especificidade do ensaio com methyllycaconitine citrato (MLA), um antagonista nAChR, que interrompe o PSI para DLMn ligação, mas não o GF para TTMn ligação ou a função do JNM no salto ou músculos de voo. Antes de começar este vídeo é fundamental que você observar cuidadosamente e se familiarizar com o vídeo intitulado &quot;JOVE gravações eletrofisiológicas da via fibra gigante de D. melanogaster &quot;de Augustin et al 7, como o vídeo aqui apresentado destina-se como uma expansão a esta técnica existente. Aqui usamos o método gravações eletrofisiológico e foco em detalhes apenas na adição dos nanoinjections emparelhados e técnicas de monitoramento.

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Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Uma rápida<em&gt; In vivo</em&gt; Ensaio para testar compostos neuromoduladores usando o sistema de fibra gigante (GFS) do<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; É descrito. Nanoinjections na cabeça do animal, juntamente com gravações eletrofisiológicas do GFS pode revelar bioatividade dos compostos nos neurônios ou músculos.

Nanoinjection emparelhado e Eletrofisiologia Ensaio para a tela de bioatividade dos compostos utilizando os Drosophila melanogaster Sistema Fibra Gigante

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

As gravações eletrofisiológicas da via fibra Gigante da D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Neurociência

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Preparação Monte todo o Adulto Drosophila Cordão nervoso ventral para injeção gigante de fibra Dye

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

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Determinação da atividade locomotora espontânea em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

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Ensaio simples para Quantificação de Prevenção Social<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

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De alta resolução Quantificação do Comportamento Odor-guiada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Usando a<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

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Clones em um ensaio comportamental para Mechanosensation de MarcM baseada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

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High Throughput Ensaio para examinar Preferências de postura de Pessoa<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

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Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

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O capilar alimentador ensaio mede ingestão alimentar em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...