Name: paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the drosophila melanogaster giant fiber system
Uploaded: 2012-04-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio y el laboratorio de Mari Godenschwege, en particular, Yonezawa Aline, por los comentarios y ayuda con este protocolo. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares de subvención R21NS06637 de FM y TAG, AB fue financiado por el número de la National Science premio de la Fundación 082925, MUR: Biología Integrativa para futuros investigadores.

1. Electrofisiología Rig Set-up <ol><li> El equipo requerido para el equipo de perforación electrofisiología configuración se describe en detalle por Augustin et al. en este Diario 14. Por favor, consulte este artículo para obtener una explicación detallada de los aparatos electrofisiológicos necesarios. </li><li> Modificar el equipo de electrofisiología se ha descrito anteriormente puesta a punto 14 mediante la adición de un micromanipulador sexto, que ocupa la nanoinjector. Pa...

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	<li>Koehn, F. E., Carter, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+role+of+natural+products+in+drug+discovery.">The evolving role of natural products in drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 4, 206-220 (2005).</li><li>Miljanich, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ziconotide:+neuronal+calcium+channel+blocker+for+treating+severe+chronic+pain.">Ziconotide: neuronal calcium channel blocker for treating severe chronic pain.</a> Curr. Med. Chem. 11, 3029-3040 (2004).</li><li>Layer, R. T., Wagstaff, J. D., White, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conantokins:+peptide+antagonists+of+NMDA+receptors.">Conantokins: peptide antagonists of NMDA receptors.</a> Curr. Med. Chem. 11, 3073-3084 (2004).</li><li>Lewis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conotoxins+as+selective+inhibitors+of+neuronal+ion+channels,+receptors+and+transporters.">Conotoxins as selective inhibitors of neuronal ion channels, receptors and transporters.</a> IUBMB Life. 56, 89-93 (2004).</li><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+an+escape:+development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system.">Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).</li><li>Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nicotinic+acetylcholine+receptor+Dalpha7+is+required+for+an+escape+behavior+in+Drosophila.">The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila.</a> PLoS biology. 4, e63 (2006).</li><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-glutamate+as+an+excitatory+transmitter+at+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction.">L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> The Journal of physiology. 262, 215-236 (1976).</li><li>Usherwood, P. N., Machili, P., Leaf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Glutamate+at+insect+excitatory+nerve-muscle+synapses.">L-Glutamate at insect excitatory nerve-muscle synapses.</a> Nature. 219, 1169-1172 (1968).</li><li>Marrus, S. B., Portman, S. L., Allen, M. J., Moffat, K. G., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localization+of+glutamate+receptor+subunits+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Differential localization of glutamate receptor subunits at the Drosophila neuromuscular junction.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1406-1415 (2004).</li><li>Petersen, S. A., Fetter, R. D., Noordermeer, J. N., Goodman, C. S., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+glutamate+receptors+in+Drosophila+reveals+a+retrograde+signal+regulating+presynaptic+transmitter+release.">Genetic analysis of glutamate receptors in Drosophila reveals a retrograde signal regulating presynaptic transmitter release.</a> Neuron. 19, 1237-1248 (1997).</li><li>Qin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+different+subunits+are+essential+for+expressing+the+synaptic+glutamate+receptor+at+neuromuscular+junctions+of+Drosophila.">Four different subunits are essential for expressing the synaptic glutamate receptor at neuromuscular junctions of Drosophila.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3209-3218 (2005).</li><li>Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+an+invertebrate+glutamate+receptor+subunit+expressed+in+Drosophila+muscle.">Molecular cloning of an invertebrate glutamate receptor subunit expressed in Drosophila muscle.</a> Science. 254, 112-114 (1991).</li><li>Tanouye, M. A., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+outputs+of+giant+nerve+fiber+in+Drosophila.">Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila.</a> Journal of. 44, 405-421 (1980).</li><li>Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Recordings+from+the+Giant+Fiber+Pathway+of+D.+melanogaster.">Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster.</a> J. Vis. Exp. (47), e2412 (2011).</li><li>Allen, M. J., Godenschwege, T., Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Neurobiology. , 215-224 (2010).</li><li>Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Null+mutation+in+shaking-B+eliminates+electrical,+but+not+chemical,+synapses+in+the+Drosophila+giant+fiber+system:+a+structural+study.">Null mutation in shaking-B eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: a structural study.</a> J. Comp. Neurol. 404, 449-458 (1999).</li><li>Thomas, J. B., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+altering+synaptic+connectivity+between+identified+neurons+in+Drosophila.">Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila.</a> J. Neurosci. 4, 530-538 (1984).</li><li>Baird, D. H., Schalet, A. P., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Passover+locus+in+Drosophila+melanogaster:+complex+complementation+and+different+effects+on+the+giant+fiber+neural+pathway.">The Passover locus in Drosophila melanogaster: complex complementation and different effects on the giant fiber neural pathway.</a> Genetics. 126, 1045-1059 (1990).</li><li>Gorczyca, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cholinergic+synapse+in+the+giant+fiber+pathway+of+Drosophila+using+conditional+mutations+of+acetylcholine+synthesis.">Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis.</a> J. Neurogenet. 1, 289-313 (1984).</li><li>Allen, M. J., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+component+of+the+mixed+GF-TTMn+synapse+in+Drosophila+melanogaster+uses+acetylcholine+as+its+neurotransmitter.">The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter.</a> The European journal of neuroscience. 26, 439-445 (2007).</li><li>Mejia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+for+in+vivo+screening+of+toxins+using+the+Drosophila+Giant+Fiber+circuit.">A novel approach for in vivo screening of toxins using the Drosophila Giant Fiber circuit.</a> Toxicon. 56, 1398-1407 (2010).</li><li>Stork, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+blood-brain+barrier+in+Drosophila.">Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila.</a> J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).</li></ol>

El bioensayo nanoinjection / electrofisiología que aquí se presenta permite una detección rápida de los compuestos en el sistema nervioso de la mosca de la fruta. Esta es una novedosa técnica in vivo que requiere pequeñas cantidades de un compuesto para provocar un efecto sobre una variedad de objetivos moleculares en un circuito bien caracterizado neuronal. Este método puede ser utilizado para probar la bioactividad de compuestos diferentes, de las toxinas desconocidas a agentes farmacológicos...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Electrodos de registro de vidrio: vidrio borosilicato capilares </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B100F-4 </td><td> 1.0mm OD, 0.58mm ID </td></tr><tr><td> Estimulador </td><td> Grass Instruments </td><td> Modelo S48 </td><td></td></tr><tr><td> Amplificador </td><td> Obtener Instruments Inc. </td><td> Modelo 5A </td><td></td></tr><tr><td> Adquisición de datos del software: Digidata </td><td> Molecular Devices </td><td> Modelo 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Los datos del software colección: pCLAMP </td><td> Molecular Devices </td><td> La versión 10 </td><td></td></tr><tr><td> Estereomicroscopio wde fibra óptica ésima microscopio de lámpara anular </td><td> AmScope </td><td> SM-4T Modelo HL250-AR </td><td></td></tr><tr><td> La disección de alcance para el montaje </td><td> AmScope </td><td> SM-2TZ </td><td></td></tr><tr><td> Manual de Kite Micromanipulador y basculante Base </td><td> World Precision Instruments </td><td> Modelo # M3301 Kite: Modelo # KITE-M3-L </td><td></td></tr><tr><td> Drosophila melanogaster Wild 10E genotipo (cepa de tipo salvaje) </td><td> Bloomington Stock Center </td><td> Foto # 3892 </td><td></td></tr><tr><td> Extractor vertical la pipeta </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Modelo 700C </td><td></td></tr><tr><td> Micropipetas de inyección de vidrio: vidrio borosilicato capilares </td><td> World Precision Instruments </td><td> Catálogo # 4878 </td&gt; <td> 1.14mm diámetro exterior, 0,5 mm ID </td></tr><tr><td> Aceite de silicona </td><td> Pescador </td><td> Catálogo # S159-500 </td><td></td></tr><tr><td> Biselador </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> KT Brown Tipo Modelo # BV-10 </td><td></td></tr><tr><td> Nanoliter2000 </td><td> World Precision Instruments </td><td> Catálogo # B203XVY </td><td></td></tr><tr><td> Colorante azul </td><td> McCormick </td><td> N / A </td><td> Ingredientes: agua, propilenglicol, FD &amp; C Azul 1, y el 0,1% Propilparabeno (conservante). </td></tr><tr><td> Methyllycaconitine citrato (MLA) </td><td> Bioscience Tocris </td><td> Catálogo # 1029 </td><td></td></tr><tr><td> Barras de plástico de cera </td><td> Hygenic Corporation (Akron, Ohio, EE.UU.) </td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table>

paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the drosophila melanogaster giant fiber system

Compuestos de cribado para la actividad in vivo puede ser utilizado como un primer paso para identificar a los candidatos que pueden ser desarrollados en 1,2 agentes farmacológicos. Hemos desarrollado un novedoso nanoinjection / electrofisiología ensayo que permite la detección de efectos moduladores bioactivos de los compuestos sobre la función de un circuito neuronal que media la respuesta de escape en la Drosophila melanogaster 3,4. Nuestro ensayo in vivo, que utiliza el sistema Drosophila gigante de fibra (EFP, Figura 1) permite la detección de diferentes tipos de compuestos, tales como pequeñas moléculas o péptidos, y requiere sólo cantidades mínimas para provocar un efecto. Además, el GFS Drosophila ofrece una gran variedad de posibles dianas moleculares en las neuronas o músculos. Las fibras gigantes (GFS) sinapsis eléctrica (uniones Gap), así como químicamente (colinérgico) en una sinapsis periférica Interneuron (PSI) y la neurona Tergo trocantéreo muscular (TTMn) 5 </sup&gt;. El PSI DLMn (neurona dorsal del músculo longitudinal) de conexión depende de Dα7 receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR) 6. Por último, las uniones neuromusculares (UNM) de la TTMn y la DLMn con el salto (TTM) y los músculos de vuelo (DLM) son glutamatérgica 7-12. Aquí, demostramos cómo inyectar cantidades nanolitros de un compuesto, mientras que la obtención de registros intracelulares electrofisiológicos del sistema de fibra gigante 13 y cómo controlar los efectos del compuesto sobre la función de este circuito. Se muestra la especificidad de la prueba con citrato de methyllycaconitine (MLA), un antagonista de nAChR, que interrumpe a la ISP a DLMn conexión, pero no el GF TTMn conexión o la función de la UNM en el salto o los músculos del vuelo. Antes de comenzar este video es muy importante que se observe con atención y se familiaricen con el video titulado &quot;Jove registros electrofisiológicos de la vía fibra gigante de D. melanogaster &quot;de Augustin et al 7, como el video que aquí se presenta pretende ser una expansión de esta técnica existente. Aquí se utiliza el método de los registros electrofisiológicos y el enfoque en detalle sólo en la suma de los pares de nanoinjections y la técnica de monitoreo.

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Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Una rápida<em&gt; En vivo</em&gt; Ensayo para probar compuestos de neuromoduladores que utilizan el sistema de fibra gigante (GFS) de los<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Se describe. Nanoinjections en la cabeza del animal, junto con registros electrofisiológicos de la EFP puede revelar la bioactividad de compuestos en las neuronas o músculos.

Nanoinjection parejas y Ensayo de electrofisiología para la detección de bioactividad de compuestos utilizando el Drosophila melanogaster Sistema de fibra gigante

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Registros electrofisiológicos de la ruta de fibra gigante de D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Investigación

Neurociencias

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

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Preparación Todo el montaje del Adulto Drosophila Cordón nervioso ventral para inyección gigante tinte de fibra

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Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

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For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...