Name: paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the drosophila melanogaster giant fiber system
Uploaded: 2012-04-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System at JoVE.com

Vi skulle vilja tacka ledamöterna i Mari lab och Godenschwege lab, i synnerhet Aline Yonezawa, för kommentarer och hjälp med detta protokoll. Detta arbete har finansierats av det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke bidrag R21NS06637 till FM och TAG, AB har finansierats av National Science Foundation Award antalet 082.925, URM: Integrativ biologi för framtida forskare.

1. Elektrofysiologi Rigg Set-up <ol><li> Erforderlig utrustning för elektrofysiologi riggen set-up beskrivs i detalj av Augustin et al. i denna tidskrift 14. Se till denna artikel för en detaljerad förklaring av de nödvändiga elektrofysiologiska apparater. </li><li> Ändra den tidigare beskrivna elektrofysiologi rig set-up 14 genom att lägga till 1/6 mikromanipulator, som håller nanoinjector. För enkel åtkomst till huvudet av djuret bör placeras mellan de två stimulerande elek...

<ol>
	<li>Koehn, F. E., Carter, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+role+of+natural+products+in+drug+discovery.">The evolving role of natural products in drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 4, 206-220 (2005).</li><li>Miljanich, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ziconotide:+neuronal+calcium+channel+blocker+for+treating+severe+chronic+pain.">Ziconotide: neuronal calcium channel blocker for treating severe chronic pain.</a> Curr. Med. Chem. 11, 3029-3040 (2004).</li><li>Layer, R. T., Wagstaff, J. D., White, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conantokins:+peptide+antagonists+of+NMDA+receptors.">Conantokins: peptide antagonists of NMDA receptors.</a> Curr. Med. Chem. 11, 3073-3084 (2004).</li><li>Lewis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conotoxins+as+selective+inhibitors+of+neuronal+ion+channels,+receptors+and+transporters.">Conotoxins as selective inhibitors of neuronal ion channels, receptors and transporters.</a> IUBMB Life. 56, 89-93 (2004).</li><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+an+escape:+development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system.">Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).</li><li>Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nicotinic+acetylcholine+receptor+Dalpha7+is+required+for+an+escape+behavior+in+Drosophila.">The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila.</a> PLoS biology. 4, e63 (2006).</li><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-glutamate+as+an+excitatory+transmitter+at+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction.">L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> The Journal of physiology. 262, 215-236 (1976).</li><li>Usherwood, P. N., Machili, P., Leaf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Glutamate+at+insect+excitatory+nerve-muscle+synapses.">L-Glutamate at insect excitatory nerve-muscle synapses.</a> Nature. 219, 1169-1172 (1968).</li><li>Marrus, S. B., Portman, S. L., Allen, M. J., Moffat, K. G., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localization+of+glutamate+receptor+subunits+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Differential localization of glutamate receptor subunits at the Drosophila neuromuscular junction.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1406-1415 (2004).</li><li>Petersen, S. A., Fetter, R. D., Noordermeer, J. N., Goodman, C. S., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+glutamate+receptors+in+Drosophila+reveals+a+retrograde+signal+regulating+presynaptic+transmitter+release.">Genetic analysis of glutamate receptors in Drosophila reveals a retrograde signal regulating presynaptic transmitter release.</a> Neuron. 19, 1237-1248 (1997).</li><li>Qin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+different+subunits+are+essential+for+expressing+the+synaptic+glutamate+receptor+at+neuromuscular+junctions+of+Drosophila.">Four different subunits are essential for expressing the synaptic glutamate receptor at neuromuscular junctions of Drosophila.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3209-3218 (2005).</li><li>Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+an+invertebrate+glutamate+receptor+subunit+expressed+in+Drosophila+muscle.">Molecular cloning of an invertebrate glutamate receptor subunit expressed in Drosophila muscle.</a> Science. 254, 112-114 (1991).</li><li>Tanouye, M. A., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+outputs+of+giant+nerve+fiber+in+Drosophila.">Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila.</a> Journal of. 44, 405-421 (1980).</li><li>Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Recordings+from+the+Giant+Fiber+Pathway+of+D.+melanogaster.">Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster.</a> J. Vis. Exp. (47), e2412 (2011).</li><li>Allen, M. J., Godenschwege, T., Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Neurobiology. , 215-224 (2010).</li><li>Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Null+mutation+in+shaking-B+eliminates+electrical,+but+not+chemical,+synapses+in+the+Drosophila+giant+fiber+system:+a+structural+study.">Null mutation in shaking-B eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: a structural study.</a> J. Comp. Neurol. 404, 449-458 (1999).</li><li>Thomas, J. B., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+altering+synaptic+connectivity+between+identified+neurons+in+Drosophila.">Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila.</a> J. Neurosci. 4, 530-538 (1984).</li><li>Baird, D. H., Schalet, A. P., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Passover+locus+in+Drosophila+melanogaster:+complex+complementation+and+different+effects+on+the+giant+fiber+neural+pathway.">The Passover locus in Drosophila melanogaster: complex complementation and different effects on the giant fiber neural pathway.</a> Genetics. 126, 1045-1059 (1990).</li><li>Gorczyca, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cholinergic+synapse+in+the+giant+fiber+pathway+of+Drosophila+using+conditional+mutations+of+acetylcholine+synthesis.">Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis.</a> J. Neurogenet. 1, 289-313 (1984).</li><li>Allen, M. J., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+component+of+the+mixed+GF-TTMn+synapse+in+Drosophila+melanogaster+uses+acetylcholine+as+its+neurotransmitter.">The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter.</a> The European journal of neuroscience. 26, 439-445 (2007).</li><li>Mejia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+for+in+vivo+screening+of+toxins+using+the+Drosophila+Giant+Fiber+circuit.">A novel approach for in vivo screening of toxins using the Drosophila Giant Fiber circuit.</a> Toxicon. 56, 1398-1407 (2010).</li><li>Stork, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+blood-brain+barrier+in+Drosophila.">Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila.</a> J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).</li></ol>

Den nanoinjection / elektrofysiologi bioassay presenteras här möjliggör en snabb screening av föreningar i nervsystemet av bananfluga. Detta är en ny in vivo-teknik som kräver små mängder av en förening för att framkalla en effekt på en mängd olika molekylära mål i en väl karakteriserad neuronala krets. Denna metod kan användas för att testa bioaktiviteten hos olika föreningar, av okända toxiner med kommersiellt tillgängliga farmakologiska medel. Här har vi visa...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet på reagens </td><td> Företaget </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Inspelning glaselektroder: borosilikatglas kapillärer </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B100F-4 </td><td> 1,0 mm OD, 0.58mm ID </td></tr><tr><td> Stimulator </td><td> Grass Instruments </td><td> Modell S48 </td><td></td></tr><tr><td> Förstärkaren </td><td> Få Instruments Inc. </td><td> Modell 5A </td><td></td></tr><tr><td> Datainsamling Programvara: Digidata </td><td> Molecular Devices </td><td> Modell 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Datainsamling programvara: pCLAMP </td><td> Molecular Devices </td><td> Version 10 </td><td></td></tr><tr><td> Stereomikroskop wed fiberoptisk mikroskop ringen illuminator </td><td> AmScope </td><td> SM-4T Modell HL250-AR </td><td></td></tr><tr><td> Dissektionsmikroskop för montering </td><td> AmScope </td><td> SM-2TZ </td><td></td></tr><tr><td> Kite Manuell mikromanipulator och lutningsfunktion Base </td><td> World Precision Instruments </td><td> Modell # M3301 Kite: Model # KITE-M3-L </td><td></td></tr><tr><td> Drosophila melanogaster Wild 10E-genotyp (vildtyp stam) </td><td> Bloomington Stock centrum </td><td> Stock # 3892 </td><td></td></tr><tr><td> Vertikal pipett avdragare </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Modell 700C </td><td></td></tr><tr><td> Injektion glas mikropipetter: Borsilikatglas kapillärer </td><td> World Precision Instruments </td><td> Katalog # 4878 </td&gt; <td> 1,14 mm OD, 0,5 mm ID </td></tr><tr><td> Silikonolja </td><td> Fisher </td><td> Catalogue # S159-500 </td><td></td></tr><tr><td> Beveler </td><td> Sutter Instrument Co </td><td> KT Brown Typ Modell # BV-10 </td><td></td></tr><tr><td> Nanoliter2000 </td><td> World Precision Instruments </td><td> Katalog # B203XVY </td><td></td></tr><tr><td> Blå karamellfärg </td><td> McCormick </td><td> N / A </td><td> Ingredienser: vatten, propylenglykol, FD &amp; C Blue 1, och 0,1% propylparaben (konserveringsmedel). </td></tr><tr><td> Methyllycaconitine citrat (MLA) </td><td> Tocris Bioscience </td><td> Catalogue # 1029 </td><td></td></tr><tr><td> Plast vaxstift </td><td> Hygienisk Corporation (Akron Ohio USA) </td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table>

paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the drosophila melanogaster giant fiber system

Avsökning av föreningar för in vivo-aktivitet kan användas som ett första steg för att identifiera kandidater som kan utvecklas till farmakologisk agens 1,2. Vi utvecklat en ny nanoinjection / elektrofysiologi analys som möjliggör detektering av bioaktiva modulerande effekter av föreningar på funktionen hos en neuronal krets som medierar flyktrespons i Drosophila melanogaster 3,4. Vår analys in vivo, som använder Drosophila Giant fibersystemet (GFS, figur 1) medger screening av olika typer av föreningar, såsom små molekyler eller peptider, och kräver endast minimala mängder för att framkalla en effekt. Dessutom erbjuder Drosophila GFS ett stort antal potentiella molekylära mål på nervceller och muskler. Giant fibrer (GF) synaps elektriskt (gap junctions) och kemiskt (kolinergisk) på en perifer Synapsing interneuron (PSI) och den Tergo trochanter-Muskel neuronen (TTMn) 5 </sup&gt;. PSI till DLMn (Dorsal längsgående muskeln neuron) anslutning beror på Dα7 nikotinacetylkolinreceptorer (nAChR) 6. Slutligen, den neuromuskulära korsningar (NMJ) av TTMn och DLMn med hopp (TTM) och muskler Flight (DLM) är glutamaterg 7-12. Här visar vi hur du ska injicera metod i nanoliter mängder av en förening, medan få elektrofysiologiska intracellulära inspelningar från Giant Fiber System 13 och hur man övervaka effekterna av föreningen på funktionen av denna krets. Vi visar specificiteten hos analysen med methyllycaconitine citrat (MLA), en nAChR-antagonist, som stör PSI till DLMn förbindelse men inte GF att TTMn anslutning eller funktionen av NMJ vid hopp eller muskler flygning. Innan du börjar denna video är det viktigt att du noggrant titta på och bekanta dig med Jové video med titeln &quot;Elektrofysiologiska inspelningar från Giant Fiber vägen för D. Melanogaster &quot;från Augustin et al 7, som video presenteras här är avsedd som en expansion till denna befintliga teknik. Här använder vi elektrofysiologiska inspelningar metoden och fokus i detalj endast om tillsättning av de parade nanoinjections och övervakningsteknik.

Watch this Scientific Journal Video about Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System at JoVE.com

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

En snabb<em&gt; In vivo</em&gt; Analys för att testa neuromodulatory föreningar med hjälp av Giant Fiber System (GFS) av<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Beskrivs. Nanoinjections i huvudet av djuret tillsammans med elektrofysiologiska inspelningar av GFS kan avslöja bioaktivitet av föreningar på nervceller och muskler.

Kopplade Nanoinjection och elektrofysiologi analys för att undersöka Bioaktivitet hos föreningar med hjälp av Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Elektrofysiologiska inspelningar från Giant Fiber stig D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

Hela berget Beredning av vuxna Drosophila På magen Nerve Snodd till Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Märkning av enstaka celler i det centrala nervsystemet hos<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Bestämning av spontan rörelseaktivitet i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Enkel analys för kvantifiering av social Undvikande i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

Högupplöst Kvantifiering av Lukt styrd Beteende i<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Använda<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

En Beteende Analys för Mechanosensation av MARCM baserade Kloner i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Hög genomströmning analys för att undersöka äggläggning preferenser Individuella<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

Ett enkelt sätt att mäta förändringar i belöning sökande beteende genom<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

Kapillären Feeder analysen mäter matkonsumtionen i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...