Name: dissection and culture of chick statoacoustic ganglion and spinal cord explants in collagen gels for neurite outgrowth assays
Uploaded: 2011-12-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door National Institutes of Health Grant RO1DC002756 en de Purdue Research Foundation. Wij danken Doris Wu en Wiese Chang voor advies met experimenten en Rodney McPhail voor hulp met cijfers.

Recepten Chick Ringers <table border="1"><tbody><tr><td> 7,2 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 0,23 g </td><td> CaCl 2 + 2H 2 O </td></tr><tr><td> 0,37 g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 0,115 g </td><td> Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 900 ml </td><td> Water (weefselkweek graad) </td></tr></tbody></table> Opmerking: Breng de pH tot 7,4. Breng uiteindelijke volume tot 1000 ml met water. 10X PBS </...

<ol>
	<li>Fekete, D. M., Campero, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+in+the+inner+ear.">Axon guidance in the inner ear.</a> Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).</li><li>Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+inner+ear+afferent+connections:+forming+primary+neurons+and+connecting+them+to+the+developing+sensory+epithelia.">Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia.</a> Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).</li><li>Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+conveys+semaphorin+and+VEGF+signaling+during+neural+and+cardiovascular+development.">Neuropilin-1 conveys semaphorin and VEGF signaling during neural and cardiovascular development.</a> Dev. Cell. 5 (1), 45-45 (2003).</li><li>Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NT-3+replacement+with+brain-derived+neurotrophic+factor+redirects+vestibular+nerve+fibers+to+the+cochlea.">NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea.</a> J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).</li><li>Avila, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+support+the+survival+and+neuritogenesis+response+of+developing+cochleovestibular+ganglion+neurons.">Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons.</a> Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).</li><li>Bianchi, L. M., Cohan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+neurotrophins+and+CNTF+on+developing+statoacoustic+neurons:+comparison+with+an+otocyst-derived+factor.">Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor.</a> Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).</li><li>Juurlink, B. e. r. n. h. a. r. d. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+Spinal+Somatic+Motoneurons+in+Culture.">Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture.</a> Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).</li><li>Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnts+and+Wnt+inhibitors+do+not+influence+axon+outgrowth+from+chicken+statoacoustic+ganglion+neurons.">Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons.</a> Hear. Res. , (2011).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).</li><li>Bourikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+guides+commissural+axons+along+the+longitudinal+axis+of+the+spinal+cord.">Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord.</a> Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).</li><li>Charron, F., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+brain+wiring+functions+for+classical+morphogens:+a+role+as+graded+positional+cues+in+axon+guidance.">Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance.</a> Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).</li><li>Augsburger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons.">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).</li><li>Lyuksyutova, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior-posterior+guidance+of+commissural+axons+by+Wnt-frizzled+signaling.">Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling.</a> Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).</li></ol>

Wij presenteren een methode te ontleden en cultuur E4 SAG en E6 ruggenmerg explantaten, van kuiken, onder serum-vrije omstandigheden. Deze procedure wordt momenteel gebruikt in ons lab aan de gevolgen van de verschillende afgescheiden liganden op SAG neuron overleving en neurietuitgroei studie. Nieuwe aspecten van dit protocol zijn het gebruik van een serum-vrij systeem voor het kweken van explantaten en het gebruik van kralen gedrenkt in groeifactoren de effecten op de SAG neurietuitgroei te bestuderen. Een kraal metho...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Commentaar </td></tr><tr><td> Uitrusting </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissection microscoop </td><td></td><td></td><td> We maken gebruik van een Leica M80 stereomicroscoop met helderveld verlichting basis </td></tr><tr><td> Slide warmer </td><td> CS &amp; E. </td><td></td><td> Collageen polymerisatie </td></tr><tr><td> Kip ei-incubator </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C / 5% CO 2 bevochtigde celkweek incubator </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissection Materialen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard &amp;kopiëren; gecoat petrischaal </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 24-well celkweek plaat </td><td> Corning </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Dumont tang </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr><tr><td> # 55 Dumont tang </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr><tr><td> Roestvrij staal ontleden pinnen </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26002-10 </td><td> Embryo pinning, fijne dissectie </td></tr><tr><td> Moria geperforeerde lepel </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10370-17 </td><td> Embryo oogst / transfer </td></tr><tr><td> 200 ul brede mond pipetpunten </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 118-96R </td><td> Explantatie overdracht </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E4 en E6 kippeneieren </td><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Chick Ringer-oplossing </td><td></td><td></td><td> Embryo oogst </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264 </td><td> SAG dissectie </td></tr><tr><td> L15 medium </td><td> Sigma </td><td> L5520 </td><td> Ruggenmerg dissectie medium </td></tr><tr><td> Foetaal kalf serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td> Ruggenmerg dissectie medium </td></tr><tr><td> Vannas Schaar </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> 501778 </td><td> Ruggenmerg dissectie </td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collageen voorbereiding </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rat-tail collageen Type I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354249 </td><td> Explantatie cultuur </td></tr><tr><td> 10X PBS (steriel) </td><td></td><td></td><td> Te neutralize collageen </td></tr><tr><td> 1N NaOH (steriel) </td><td></td><td></td><td> Te neutraliseren collageen </td></tr><tr><td> Gedistilleerd water (steriel) </td><td></td><td></td><td> Te neutraliseren collageen </td></tr><tr><td> pH-indicator papers (6.0-8.1) </td><td> Whatman papier </td><td> 2629-990 </td><td> Om te controleren collageen pH-waarde </td></tr><tr><td> 15 ml conische buizen </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 818-PG </td><td></td></tr><tr><td> 500 pi brede mond pipetpunten </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 119-R100 </td><td> Om pipet collageen </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Explantatie cultuur </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 medium </td><td> Sigma </td><td> D8437 </td><td> Explantatie kweekmedium </td></tr><tr><td> ITS +1 </td><td> Sigma </td><td> I2521 </td><td> Medium aan te vullen </td&gt; </tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> Medium aan te vullen </td></tr><tr><td> CNTF (rat) </td><td> Sigma </td><td> C3835 </td><td> Medium aan te vullen </td></tr><tr><td> NT-3 (menselijke) </td><td> Sigma </td><td> N1905 </td><td> Medium aan te vullen </td></tr><tr><td> Gezuiverd muis Wnt5a </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 645-WN-010 </td><td></td></tr><tr><td> Affi-gel Blue gel kralen </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7302 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immunohistochemie </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td> Bevestiging </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> Spoelt </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td><td> Blockingbuffer </td></tr><tr><td> Natriumazide </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td> Blockingbuffer </td></tr><tr><td> Kalfsserum </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td><td> Blockingbuffer </td></tr><tr><td> Muizen monoklonaal IgG2b anti-β tubuline 1 + II antilichaam </td><td> Sigma </td><td> T8535 </td><td> Labels cellichamen en neurieten </td></tr><tr><td> Alexa fluor 488 geit anti-muis antilichaam IgG2 b </td><td> Invitrogen </td><td> A21141 </td><td> Detecteert β tubuline antilichaam </td></tr><tr><td> Teflon micro spatel </td><td> VWR </td><td> 57949-033 </td><td> Laat collageen gels van goed </td></tr></tbody></table>

dissection and culture of chick statoacoustic ganglion and spinal cord explants in collagen gels for neurite outgrowth assays

De zintuigen van de kip binnenoor worden geïnnerveerd door de perifere processen van statoacoustic ganglion (SAG) neuronen. Zintuig innervatie is afhankelijk van een combinatie van een axon begeleiding signalen 1 en 2 survival factoren gelegen langs het traject van de groeiende axonen en / of binnen hun zintuig doelen. Bijvoorbeeld, functionele interferentie met een klassieke axon begeleiding signaalweg, semaphorin-neuropilin, gegenereerd misrouting van otic axonen 3. Ook verschillende groeifactoren, uitgedrukt in de sensorische doelstellingen van het binnenoor, waaronder neurotrofine-3 (NT-3) en Brain afgeleide neurotrofe factor (BDNF), zijn gemanipuleerd in transgene dieren, weer wat leidt tot misrouting van SAG axonen 4. Deze zelfde moleculen bevorderen, zowel overleving en uitgroei van neurieten van kuiken SAG neuronen in vitro 5,6. We beschrijven hier en demonstreren van de in-vitro-methode die wij op dit moment are uzingen voor de responsiviteit van kuiken SAG neurieten test om oplosbare eiwitten, waaronder bekende morphogens zoals de Wnts, evenals de groei factoren die van belang zijn voor het bevorderen van SAG neurietuitgroei en neuron overleven. Met behulp van dit model systeem, hopen we conclusies over de effecten die uitgescheiden liganden kunnen uitoefenen op de SAG neuron overleving en neurietuitgroei trekken. SAG explantaten worden ontleed op embryonale dag 4 (E4) en gekweekt in drie-dimensionale collageen gels onder serum-vrije omstandigheden gedurende 24 uur. Ten eerste is neurieten reactievermogen getest door het kweken van explantaten met eiwit-aangevuld medium. Dan, om te vragen of puntbronnen van uitgescheiden liganden kunnen directionele effecten op neurietuitgroei hebben, zijn explantaten samen gekweekt met eiwit-gecoate kralen en getest op het vermogen van de kraal om lokaal bevorderen of belemmeren uitgroei. We hebben ook een demonstratie van de dissectie (gewijzigde protocol 7) en de cultuur van E6 ruggenmerg explantaten. Wijroutinematig gebruik van het ruggenmerg explantaten op bioactiviteit van de eiwitten en eiwit-doordrenkte kralen te bevestigen en te controleren soort cross-reactiviteit met chick weefsel, onder dezelfde voorwaarden als de cultuur SAG explantaten. Deze in vitro testen zijn handig voor het snel screenen op moleculen die trofische (overleving) of tropische (directionele) effecten op de SAG neuronen uit te oefenen, vooral vóór het uitvoeren van studies in vivo. Bovendien is deze methode maakt het testen van individuele moleculen onder serum-vrije omstandigheden, met een hoge neuron overleven 8.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays at JoVE.com

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

Laten we zien hoe te ontleden en cultuur chick E4 statoacoustic ganglion en E6 ruggenmerg explantaten. Explantaten worden gekweekt onder serum-vrije omstandigheden in 3D collageen gels voor 24 uur. Neurieten responsiviteit is getest met de groei factor-aangevuld medium en met eiwit-gecoate kralen.

Dissectie en Cultuur van Chick Statoacoustic Ganglion en Spinal Cord Explantaten in Collageen Gels voor neurietuitgroei Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Een Functionele Motor-eenheid in de cultuur Dish: Co-cultuur van het ruggenmerg Explantaten-en spiercellen

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Dissectie en Cultuur van de muis Dopaminerge en het striatum Explantaten in drie-dimensionale Collageen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Cultuur Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Dissectie en horizontale bevestiging van de zebravis embryo&#39;s: Analyse van Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Compleet ruggenmergletsel en Brain Dissection Protocol voor Latere Wholemount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in Larvale Overzeese Lamprei

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq Analyse van differentiële genexpressie in Geëlektroporeerde Chick Embryonale Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Een procedure voor het implanteren van een Spinal Kamer voor Longitudinaal<em&gt; In Vivo</em&gt; Beeldvorming van de Muis Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Spinal Cord Neurons Isolatie en Cultuur van Neonatale Muizen

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arteriële levering van neurale stamcellen aan de Rat en Mouse Brain: Toepassing op cerebrale ischemie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...