Name: dissection and culture of chick statoacoustic ganglion and spinal cord explants in collagen gels for neurite outgrowth assays
Uploaded: 2011-12-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants RO1DC002756 und der Purdue Research Foundation finanziert. Wir bedanken uns bei Doris Wu und Chang Wiese für Beratung mit Experimenten und Rodney McPhail für die Hilfe bei Zahlen.

Rezepte Küken Ringers <table border="1"><tbody><tr><td> 7,2 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 0,23 g </td><td> CaCl 2 + 2H 2 O </td></tr><tr><td> 0,37 g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 0,115 g </td><td> Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 900 ml </td><td> Water (Tissue culture grade) </td></tr></tbody></table> Hinweis: Der pH-Wert auf 7,4. Bringen Endvolumen von 1000 ml mit Wasser. 10X PBS <tabl...

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	<li>Fekete, D. M., Campero, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+in+the+inner+ear.">Axon guidance in the inner ear.</a> Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).</li><li>Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+inner+ear+afferent+connections:+forming+primary+neurons+and+connecting+them+to+the+developing+sensory+epithelia.">Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia.</a> Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).</li><li>Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+conveys+semaphorin+and+VEGF+signaling+during+neural+and+cardiovascular+development.">Neuropilin-1 conveys semaphorin and VEGF signaling during neural and cardiovascular development.</a> Dev. Cell. 5 (1), 45-45 (2003).</li><li>Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NT-3+replacement+with+brain-derived+neurotrophic+factor+redirects+vestibular+nerve+fibers+to+the+cochlea.">NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea.</a> J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).</li><li>Avila, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+support+the+survival+and+neuritogenesis+response+of+developing+cochleovestibular+ganglion+neurons.">Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons.</a> Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).</li><li>Bianchi, L. M., Cohan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+neurotrophins+and+CNTF+on+developing+statoacoustic+neurons:+comparison+with+an+otocyst-derived+factor.">Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor.</a> Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).</li><li>Juurlink, B. e. r. n. h. a. r. d. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+Spinal+Somatic+Motoneurons+in+Culture.">Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture.</a> Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).</li><li>Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnts+and+Wnt+inhibitors+do+not+influence+axon+outgrowth+from+chicken+statoacoustic+ganglion+neurons.">Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons.</a> Hear. Res. , (2011).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).</li><li>Bourikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+guides+commissural+axons+along+the+longitudinal+axis+of+the+spinal+cord.">Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord.</a> Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).</li><li>Charron, F., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+brain+wiring+functions+for+classical+morphogens:+a+role+as+graded+positional+cues+in+axon+guidance.">Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance.</a> Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).</li><li>Augsburger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons.">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).</li><li>Lyuksyutova, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior-posterior+guidance+of+commissural+axons+by+Wnt-frizzled+signaling.">Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling.</a> Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).</li></ol>

Wir stellen eine Methode zu sezieren und Kultur E4 und E6 SAG Rückenmark Explantate von chick, unter serumfreien Bedingungen. Dieses Verfahren wird derzeit in unserem Labor verwendet werden, um die Auswirkungen von verschiedenen sezernierten Liganden auf SAG Neuron Überleben und Neuritenwachstum zu studieren. Neue Aspekte dieses Protokolls sind die Verwendung eines serumfreien System zur Kultivierung von Explantaten und die Verwendung von Perlen in Wachstumsfaktoren getränkt, um Auswirkungen auf die SAG Neuritenwachs...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> Ausrüstung </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissektionsmikroskop </td><td></td><td></td><td> Wir verwenden ein Stereomikroskop Leica M80 mit Hellfeld Basis Beleuchtung </td></tr><tr><td> Slide wärmer </td><td> CS &amp; E. </td><td></td><td> Collagen Polymerisation </td></tr><tr><td> Hühnerei-Inkubator </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C / 5% CO 2 befeuchtet Zellkulturbrutschrank </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissection Materials </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard &amp;copy; beschichtete Petrischale </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 24-Well-Zellkulturplatte </td><td> Corning </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Dumont Pinzetten </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr><tr><td> # 55 Dumont Pinzetten </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr><tr><td> Edelstahl Sezieren Pins </td><td> Feine Science Tools </td><td> 26002-10 </td><td> Embryo Pinning, feinen Sezierung </td></tr><tr><td> Moria Schaumlöffel </td><td> Feine Science Tools </td><td> 10370-17 </td><td> Embryo Ernte / Transfer </td></tr><tr><td> 200 ul breiten Mund Pipettenspitzen </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 118-96R </td><td> Explantation Transfer </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E4 und E6 Hühnereiern </td><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Küken Ringer-Lösung </td><td></td><td></td><td> Embryo Ernte </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264 </td><td> SAG Dissektion </td></tr><tr><td> L15 Medium </td><td> Sigma </td><td> L5520 </td><td> Rückenmark Dissektion Medium </td></tr><tr><td> Fötalem Kälberserum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td> Rückenmark Dissektion Medium </td></tr><tr><td> Vannas Scissors </td><td> World Precision Instruments </td><td> 501778 </td><td> Rückenmark Dissektion </td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collagen Vorbereitung </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rat-tail Kollagen Typ I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354249 </td><td> Explantation Kultur </td></tr><tr><td> 10X PBS (steril) </td><td></td><td></td><td> Um neutralize Kollagen </td></tr><tr><td> 1N NaOH (steril) </td><td></td><td></td><td> Zur Neutralisierung Kollagen </td></tr><tr><td> Destilliertes Wasser (steril) </td><td></td><td></td><td> Zur Neutralisierung Kollagen </td></tr><tr><td> pH-Indikator Papiere (6,0-8,1) </td><td> Whatman </td><td> 2629-990 </td><td> Um zu überprüfen, Kollagen pH </td></tr><tr><td> 15 ml konischen Röhrchen </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 818-PG </td><td></td></tr><tr><td> 500 ul breiten Mund Pipettenspitzen </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 119-R100 </td><td> Um pipet Kollagen </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Explantation Kultur </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12-Medium </td><td> Sigma </td><td> D8437 </td><td> Explantation Kulturmedium </td></tr><tr><td> Ihre +1 </td><td> Sigma </td><td> I2521 </td><td> Medium ergänzen </td&gt; </tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> Medium ergänzen </td></tr><tr><td> CNTF (Ratte) </td><td> Sigma </td><td> C3835 </td><td> Medium ergänzen </td></tr><tr><td> NT-3 (human) </td><td> Sigma </td><td> N1905 </td><td> Medium ergänzen </td></tr><tr><td> Gereinigtes Maus Wnt5a </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 645-WN-010 </td><td></td></tr><tr><td> Affi-Gel Blue Gelperlen </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7302 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immunhistochemie </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td> Fixierung </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> Spülungen </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td><td> Blocking-Lösung </td></tr><tr><td> NatriumAzid </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td> Blocking-Lösung </td></tr><tr><td> Kälberserum </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td><td> Blocking-Lösung </td></tr><tr><td> Monoklonalen Maus-IgG2b anti-β Tubulin 1 + II Antikörper </td><td> Sigma </td><td> T8535 </td><td> Labels Zellkörper und Neuriten </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus IgG2 b-Antikörper </td><td> Invitrogen </td><td> A21141 </td><td> Erkennt β Tubulin Antikörper </td></tr><tr><td> Teflon Mikrospatel </td><td> VWR </td><td> 57949-033 </td><td> Veröffentlichung Kollagengelen von gut </td></tr></tbody></table>

dissection and culture of chick statoacoustic ganglion and spinal cord explants in collagen gels for neurite outgrowth assays

Die Sinnesorgane des Huhns Innenohr werden durch die peripheren Prozesse statoacoustic Ganglion (SAG) Neuronen innerviert. Sinnesorgan Innervation beruht auf einer Kombination von Axon Führung Signale 1 und Überlebensfaktoren 2 entlang der Flugbahn der wachsenden Axone und / oder in ihren Sinnesorgan Ziele entfernt. Zum Beispiel erzeugt funktionelle Störungen mit einem klassischen Axon Führung Signalweg, Semaphorin-Neuropilin, Fehlleitung von otic Axone 3. Auch mehrere Wachstumsfaktoren in den sensorischen Ziele des Innenohrs, darunter Neurotrophin-3 (NT-3) und Brain Derived neurotrophen Faktor (BDNF), ausgedrückt in transgene Tiere manipuliert worden, was wiederum zu der SAG Axone 4 Fehlleitung. Dieselben Moleküle fördern sowohl das Überleben und die Neuritenwachstum chick SAG Neuronen in vitro 5,6. Hier beschreiben wir und zeigen die In-vitro-Methode, die wir derzeit usingen, um die Reaktionsfähigkeit von chick SAG Neuriten, lösliche Proteine, einschließlich bekannter Morphogene wie die Wnts, sowie Wachstumsfaktoren, die wichtig für die Förderung der SAG Neuritenwachstum und Neuron Überleben zu testen. Mit diesem Modellsystem, hoffen wir Rückschlüsse auf die Effekte, die sezernierte Liganden auf SAG Neuron Überleben und Neuritenwachstum ausüben kann zeichnen. SAG Explantate an embryonalen Tag 4 (E4) präpariert und kultiviert im dreidimensionalen Kollagen-Gelen unter serumfreien Bedingungen für 24 Stunden. Erstens ist Neuriten Reaktionsfähigkeit durch Kultivierung Explantate mit Protein-ergänzt Medium getestet. Dann, um zu fragen, ob Punktquellen von sekretierten Liganden können direktionale Effekte auf Neuritenwachstum haben, sind Explantate mit Protein-beschichteten Beads co-kultiviert und untersucht für die Fähigkeit der Raupe vor Ort zu fördern oder hemmen Auswuchs. Wir berücksichtigen auch eine Demonstration der Dissektion (modifizierten Protokoll 7) und die Kultur der E6 Rückenmark Explantate. Wirroutinemäßig Rückenmark Explantate auf Bioaktivität der Proteine ​​und Protein-getränkte Perlen zu bestätigen, und um zu überprüfen Spezies Kreuzreaktivität mit chick Gewebe, unter den gleichen Kulturbedingungen wie SAG Explantate. Diese in-vitro-Assays sind für das schnelle Screening nach Molekülen, die trophische (Überlebensrate) oder tropic (Richt-) Wirkungen auf SAG Neuronen ausüben, insbesondere vor der Durchführung von Studien in vivo bequem. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode die Prüfung von einzelnen Molekülen unter serumfreien Bedingungen mit hoher Neuron Überleben 8.

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Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

Wir zeigen, wie zu sezieren und Kultur chick E4 statoacoustic Ganglion und E6 Rückenmark Explantate. Explantate unter serumfreien Bedingungen in 3D-Kollagen-Gele für 24 Stunden kultiviert. Neuriten Reaktionsfähigkeit ist mit Wachstumsfaktor-ergänzt mittel-und mit Protein-beschichteten Beads getestet.

Dissection und Kultur von Chick Statoacoustic Ganglion und Rückenmark Explantate in Kollagengelen für Neuritenwachstum Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Ein Functional Motor Unit in der Kulturschale: Co-Kultur von Spinal Cord Explantate und Muskelzellen

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Dissection und Kultur von Maus-dopaminergen und Striatale Explantate in dreidimensionalen Kollagen-Matrix-Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Hühnerembryo Spinal Cord Scheibe Kultur Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Dissection und seitlicher Anbau von Zebrafisch-Embryonen: Analyse der Rückenmarksentwicklung

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Komplette Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protokoll für spätere Wholemount<em&gt; In-situ</em&gt; Hybridisierung in Larven Seeneunauge

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq Analyse der differentiellen Genexpression in elektroporiertem Küken Embryonale Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging der Maus Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Wirbelsäule Neuronen Isolierung und Kultur aus neonatalen Mäusen

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arterielle Lieferung von neuronalen Stammzellen an das Ratten- und Maushirn: Anwendung auf zerebrale Ischämie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...