Name: dissection and culture of chick statoacoustic ganglion and spinal cord explants in collagen gels for neurite outgrowth assays
Uploaded: 2011-12-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health di Grant RO1DC002756 e la Purdue Research Foundation. Ringraziamo Wu Doris e Wiese Chang per la consulenza con esperimenti e McPhail Rodney aiuto con figure.

Ricette Chick Ringers <table border="1"><tbody><tr><td> 7,2 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 0,23 g </td><td> CaCl 2 + 2H 2 O </td></tr><tr><td> 0,37 g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 0,115 g </td><td> Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 900 ml </td><td> Acqua (cultura grado Tissue) </td></tr></tbody></table> Nota: Regolare il pH a 7,4. Portare il volume finale a 1000 ml con acqua. PBS 10X <tabl...

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	<li>Fekete, D. M., Campero, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+in+the+inner+ear.">Axon guidance in the inner ear.</a> Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).</li><li>Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+inner+ear+afferent+connections:+forming+primary+neurons+and+connecting+them+to+the+developing+sensory+epithelia.">Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia.</a> Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).</li><li>Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+conveys+semaphorin+and+VEGF+signaling+during+neural+and+cardiovascular+development.">Neuropilin-1 conveys semaphorin and VEGF signaling during neural and cardiovascular development.</a> Dev. Cell. 5 (1), 45-45 (2003).</li><li>Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NT-3+replacement+with+brain-derived+neurotrophic+factor+redirects+vestibular+nerve+fibers+to+the+cochlea.">NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea.</a> J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).</li><li>Avila, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+support+the+survival+and+neuritogenesis+response+of+developing+cochleovestibular+ganglion+neurons.">Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons.</a> Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).</li><li>Bianchi, L. M., Cohan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+neurotrophins+and+CNTF+on+developing+statoacoustic+neurons:+comparison+with+an+otocyst-derived+factor.">Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor.</a> Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).</li><li>Juurlink, B. e. r. n. h. a. r. d. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+Spinal+Somatic+Motoneurons+in+Culture.">Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture.</a> Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).</li><li>Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnts+and+Wnt+inhibitors+do+not+influence+axon+outgrowth+from+chicken+statoacoustic+ganglion+neurons.">Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons.</a> Hear. Res. , (2011).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).</li><li>Bourikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+guides+commissural+axons+along+the+longitudinal+axis+of+the+spinal+cord.">Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord.</a> Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).</li><li>Charron, F., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+brain+wiring+functions+for+classical+morphogens:+a+role+as+graded+positional+cues+in+axon+guidance.">Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance.</a> Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).</li><li>Augsburger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons.">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).</li><li>Lyuksyutova, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior-posterior+guidance+of+commissural+axons+by+Wnt-frizzled+signaling.">Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling.</a> Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).</li></ol>

Vi presentiamo un metodo per sezionare e cultura SAG E4 ed E6 espianti midollo spinale, da ragazza, sotto siero senza condizioni. Questa procedura è attualmente utilizzato nel nostro laboratorio per studiare gli effetti dei vari ligandi secreto SAG sulla sopravvivenza dei neuroni e crescita dei neuriti. Nuovi aspetti di questo protocollo includono l&#39;uso di un siero privo di espianti di sistema per la coltura e l&#39;uso di perline imbevute di fattori di crescita per studiare gli effetti sulla escrescenza SAG neurit...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commento </td></tr><tr><td> Attrezzatura </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissezione microscopio </td><td></td><td></td><td> Usiamo un stereomicroscopio Leica M80 con campo chiaro di base di illuminazione </td></tr><tr><td> Far scorrere più caldi </td><td> CS &amp; E. </td><td></td><td> Collagene polimerizzazione </td></tr><tr><td> Pollo uovo incubatore </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C / 5% CO 2 umidificata coltura cellulare incubatore </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissezione Materiali </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard &amp;copia; rivestito capsula di Petri </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 24-oltre piastra di coltura cellulare </td><td> Corning </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Dumont forcipe </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr><tr><td> # 55 Dumont forcipe </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr><tr><td> Perni in acciaio inox dissezione </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 26002-10 </td><td> Embrione pinning, dissezione multa </td></tr><tr><td> Moria mestolo forato </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 10370-17 </td><td> Embrione raccolta / trasferimento </td></tr><tr><td> 200 ul larga bocca pipetta suggerimenti </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 118-96R </td><td> Espianto trasferimento </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E4 e uova di gallina E6 </td><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Soluzione pulcino Ringer </td><td></td><td></td><td> Embrione vendemmia </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264 </td><td> SAG dissezione </td></tr><tr><td> L15 media </td><td> Sigma </td><td> L5520 </td><td> Midollo spinale medio dissezione </td></tr><tr><td> Siero di vitello fetale </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td> Midollo spinale medio dissezione </td></tr><tr><td> Vännäs Forbici </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 501778 </td><td> Dissezione del midollo spinale </td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Collagene preparazione </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rat-tail collagene di tipo I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354249 </td><td> Espianto cultura </td></tr><tr><td> 10X PBS (sterili) </td><td></td><td></td><td> Per neutralize collagene </td></tr><tr><td> NaOH 1N (sterili) </td><td></td><td></td><td> Per neutralizzare collagene </td></tr><tr><td> Acqua distillata (sterile) </td><td></td><td></td><td> Per neutralizzare collagene </td></tr><tr><td> pH carte indicatore (6,0-8,1) </td><td> Whatman </td><td> 2629-990 </td><td> Per controllare il pH collagene </td></tr><tr><td> Provette da 15 ml </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 818-PG </td><td></td></tr><tr><td> 500 microlitri larga bocca pipetta suggerimenti </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 119-R100 </td><td> Al collagene pipetta </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Espianto cultura </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 media </td><td> Sigma </td><td> D8437 </td><td> Espianto terreno di coltura </td></tr><tr><td> IL SUO 1 </td><td> Sigma </td><td> I2521 </td><td> Supplemento media </td&gt; </tr><tr><td> Penicillina-Streptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> Supplemento media </td></tr><tr><td> CNTF (ratto) </td><td> Sigma </td><td> C3835 </td><td> Supplemento media </td></tr><tr><td> NT-3 (umano) </td><td> Sigma </td><td> N1905 </td><td> Supplemento media </td></tr><tr><td> Purificato del mouse Wnt5a </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 645-WN-010 </td><td></td></tr><tr><td> Affi-gel blu gel perline </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7302 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immunoistochimica </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td> Fissazione </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> Risciacqui </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td><td> Soluzione bloccante </td></tr><tr><td> Sodioazide </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td> Soluzione bloccante </td></tr><tr><td> Siero di vitello </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td><td> Soluzione bloccante </td></tr><tr><td> Monoclonale IgG2b anti-tubulina β 1 ​​+ II anticorpi </td><td> Sigma </td><td> T8535 </td><td> Corpi cellulari etichette e neuriti </td></tr><tr><td> Alexa fluor 488 capra anti-topo IgG2 anticorpi b </td><td> Invitrogen </td><td> A21141 </td><td> Rileva anticorpi β tubulina </td></tr><tr><td> Micro teflon spatola </td><td> VWR </td><td> 57949-033 </td><td> Gel di collagene rilascio da ben </td></tr></tbody></table>

dissection and culture of chick statoacoustic ganglion and spinal cord explants in collagen gels for neurite outgrowth assays

Gli organi sensoriali dell&#39;orecchio interno di pollo sono innervate dai processi periferici del ganglio statoacoustic (SAG) neuroni. Innervazione organo sensoriale dipende da una combinazione di segnali guida degli assoni 1 e fattori di sopravvivenza 2 situata lungo la traiettoria degli assoni in crescita e / o all&#39;interno degli stessi obiettivi degli organi sensoriali. Per esempio, l&#39;interferenza funzionale con un percorso classico di guida degli assoni segnalazione, semaforina-Neuropilin, generato misrouting di assoni otic 3. Inoltre, diversi fattori di crescita espresse negli obiettivi sensoriali dell&#39;orecchio interno, compresi neurotrofina-3 (NT-3) e del fattore neurotrofico cervello derivato (BDNF), sono stati manipolati in animali transgenici, ancora una volta porta a misrouting di assoni SAG 4. Queste stesse molecole promuovere sia la sopravvivenza e la crescita dei neuriti dei neuroni SAG pulcino in vitro 5,6. Qui, descriviamo e dimostrare il metodo in vitro stiamo ucantare per testare la reattività dei neuriti SAG pulcino alle proteine ​​solubili, tra cui morfogeni noto come il Wnts, così come fattori di crescita che sono importanti per la promozione dei neuriti escrescenza SAG e la sopravvivenza dei neuroni. Usando questo sistema modello, speriamo di trarre conclusioni circa gli effetti che ligandi secreto può esercitare sulla sopravvivenza dei neuroni e SAG crescita dei neuriti. Espianti SAG sono sezionato il giorno embrionale 4 (E4) e coltivate in gel tridimensionale di collagene sotto siero senza condizioni per 24 ore. In primo luogo, la reattività dei neuriti è testato da espianti coltura integrata con proteine ​​di media. Poi, per chiedere se fonti puntuali di ligandi secreto può avere effetti direzionali sulla crescita dei neuriti, gli espianti sono co-coltura con le proteine ​​rivestite perline e analizzati per la capacità del cordone di promuovere a livello locale o inibire escrescenza. Abbiamo anche una dimostrazione della dissezione (modificato protocollo 7) e la cultura della E6 espianti midollo spinale. Noiabitualmente uso espianti midollo spinale per confermare bioattività delle proteine ​​e proteine-impregnati perline, e per verificare le specie reattività crociata con i tessuti pulcino, alle condizioni stessa cultura espianti SAG. Questi test in vitro sono utili per lo screening rapido per le molecole che esercitano trofico (sopravvivenza) o tropico (direzionale) effetti sui neuroni SAG, soprattutto prima di effettuare studi in vivo. Inoltre, questo metodo permette la sperimentazione di singole molecole sotto siero senza condizioni, con alta sopravvivenza dei neuroni 8.

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Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

Dimostriamo come sezionare e cultura pulcino ganglio statoacoustic E4 ed E6 espianti midollo spinale. Espianti sono coltivate sotto siero senza condizioni in gel di collagene 3D per 24 ore. Reattività dei neuriti è testato con fattore di crescita integrata medie e con le proteine ​​rivestite perline.

Dissezione e Cultura della gangliari Chick Statoacoustic Espianti e del midollo spinale in gel di collagene per saggi crescita dei neuriti

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Ricerca

Neuroscienze

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Un gruppo motore funzionale nella piastra di coltura: Co-coltura degli espianti midollo spinale e le cellule muscolari

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Dissezione e Cultura del mouse dopaminergici e striatali Espianti di saggi di collagene matrice tridimensionale

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Embrione di pollo midollo spinale Fetta protocollo Cultura

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Dissezione e laterale Montaggio di embrioni di zebrafish: analisi dello sviluppo del midollo spinale

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Completa lesioni del midollo spinale e del cervello dissezione Protocollo per Wholemount successiva<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in larvale Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq Analisi di espressione genica differenziale in elettroporate Chick embrionali del midollo spinale

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

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Una procedura di impianto del Camera spinale per longitudinale<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging del cavo del mouse spinale

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Isolamento e cultura dei neuroni del midollo spinale da topi neonatali

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Consegna intra-arteriosa di cellule staminali neurali al cervello di ratto e topo: applicazione all'ischemia cerebrale

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...