Name: dissection and culture of chick statoacoustic ganglion and spinal cord explants in collagen gels for neurite outgrowth assays
Uploaded: 2011-12-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grant RO1DC002756 ea Purdue Research Foundation. Agradecemos a Doris Chang Wu e Wiese para o conselho com experimentos e McPhail Rodney para ajudar com números.

Receitas Pinto Ringers <table border="1"><tbody><tr><td> 7,2 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 0,23 g </td><td> CaCl 2 + 2H 2 O </td></tr><tr><td> 0,37 g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 0,115 g </td><td> Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 900 ml </td><td> Água (grau de cultura de tecidos) </td></tr></tbody></table> Nota: Ajustar o pH para 7,4. Trazer um volume final de 1000 ml com água. PBS 10X </...

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	<li>Fekete, D. M., Campero, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+in+the+inner+ear.">Axon guidance in the inner ear.</a> Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).</li><li>Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+inner+ear+afferent+connections:+forming+primary+neurons+and+connecting+them+to+the+developing+sensory+epithelia.">Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia.</a> Brain Res. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+support+the+survival+and+neuritogenesis+response+of+developing+cochleovestibular+ganglion+neurons.">Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons.</a> Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).</li><li>Bianchi, L. M., Cohan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+neurotrophins+and+CNTF+on+developing+statoacoustic+neurons:+comparison+with+an+otocyst-derived+factor.">Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor.</a> Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).</li><li>Juurlink, B. e. r. n. h. a. r. d. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+Spinal+Somatic+Motoneurons+in+Culture.">Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture.</a> Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).</li><li>Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnts+and+Wnt+inhibitors+do+not+influence+axon+outgrowth+from+chicken+statoacoustic+ganglion+neurons.">Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons.</a> Hear. Res. , (2011).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).</li><li>Bourikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+guides+commissural+axons+along+the+longitudinal+axis+of+the+spinal+cord.">Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord.</a> Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).</li><li>Charron, F., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+brain+wiring+functions+for+classical+morphogens:+a+role+as+graded+positional+cues+in+axon+guidance.">Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance.</a> Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).</li><li>Augsburger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons.">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).</li><li>Lyuksyutova, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior-posterior+guidance+of+commissural+axons+by+Wnt-frizzled+signaling.">Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling.</a> Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).</li></ol>

Nós apresentamos um método para dissecar e cultura SAG E4 e E6 explantes medula espinhal, de bico, sob soro livre de condições. Este procedimento é usado atualmente em nosso laboratório para estudar os efeitos de vários ligantes secretada na sobrevivência SAG neurônio e crescimento de neuritos. Aspectos inovadores deste protocolo incluem o uso de um sistema isento de soro, para explantes cultura eo uso de contas embebido em fatores de crescimento para estudar os efeitos sobre crescimento de neuritos SAG. Um mé...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> Equipamento </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de dissecção </td><td></td><td></td><td> Nós usamos uma Leica M80 estereomicroscópio com brightfield base de iluminação </td></tr><tr><td> Deslize mais quentes </td><td> CS &amp; E. </td><td></td><td> Colágeno polimerização </td></tr><tr><td> Frango ovo incubadora </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C / 5% CO 2 umidificado de cultura de células incubadora </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Materiais dissecção </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard &amp;cópia; placa de Petri revestidas </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 24 poços da placa de cultura de células </td><td> Corning </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Dumont forceps </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr><tr><td> # 55 Dumont forceps </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr><tr><td> Pinos de aço inoxidável de dissecação </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 26002-10 </td><td> Embrião pinagem, dissecção fina </td></tr><tr><td> Moria colher perfurada </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 10370-17 </td><td> Colheita de embriões / transferência </td></tr><tr><td> 200 mL pontas de pipeta de boca larga </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 118-96R </td><td> Transferência de explante </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E4 e E6 ovos de galinha </td><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Pinto solução de Ringer </td><td></td><td></td><td> Colheita de embriões </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264 </td><td> SAG dissecção </td></tr><tr><td> L15 médio </td><td> Sigma </td><td> L5520 </td><td> Médio dissecção da medula espinhal </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td> Médio dissecção da medula espinhal </td></tr><tr><td> Vannas Tesoura </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 501778 </td><td> Dissecção da medula espinhal </td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Preparação de colágeno </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rat-tail colágeno tipo I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354249 </td><td> Cultura de explantes </td></tr><tr><td> PBS 10X (estéril) </td><td></td><td></td><td> Para neutralize colágeno </td></tr><tr><td> NaOH 1N (estéril) </td><td></td><td></td><td> Para neutralizar colágeno </td></tr><tr><td> Água destilada (estéril) </td><td></td><td></td><td> Para neutralizar colágeno </td></tr><tr><td> pH papéis indicador (6,0-8,1) </td><td> Whatman </td><td> 2629-990 </td><td> Para verificar o pH colágeno </td></tr><tr><td> 15 ml tubos cônicos </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 818-PG </td><td></td></tr><tr><td> 500 mL pontas de pipeta de boca larga </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 119-R100 </td><td> Ao colágeno pipeta </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cultura de explantes </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 médio </td><td> Sigma </td><td> D8437 </td><td> Explante meio de cultura </td></tr><tr><td> ITS 1 </td><td> Sigma </td><td> I2521 </td><td> Suplemento médio </td&gt; </tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> Suplemento médio </td></tr><tr><td> CNTF (rato) </td><td> Sigma </td><td> C3835 </td><td> Suplemento médio </td></tr><tr><td> NT-3 (humano) </td><td> Sigma </td><td> N1905 </td><td> Suplemento médio </td></tr><tr><td> Purificada do mouse Wnt5a </td><td> R &amp; D Systems </td><td> WN-645-010 </td><td></td></tr><tr><td> Affi-gel gel contas azuis </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7302 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Imuno-histoquímica </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td> Fixação </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> Lavagens </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td><td> Solução de bloqueio </td></tr><tr><td> Sódioazida </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td> Solução de bloqueio </td></tr><tr><td> Soro bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td><td> Solução de bloqueio </td></tr><tr><td> Monoclonal anti-tubulina IgG2b β 1 + anticorpo II </td><td> Sigma </td><td> T8535 </td><td> Etiquetas corpos celulares e neurites </td></tr><tr><td> Alexa flúor 488 cabra anti-rato IgG2 de anticorpos b </td><td> Invitrogen </td><td> A21141 </td><td> Detecta anticorpos β tubulina </td></tr><tr><td> Teflon micro espátula </td><td> VWR </td><td> 57949-033 </td><td> Géis de colágeno liberação do bem </td></tr></tbody></table>

dissection and culture of chick statoacoustic ganglion and spinal cord explants in collagen gels for neurite outgrowth assays

Os órgãos sensoriais do ouvido interno de frango são inervados pelos processos periféricos do gânglio statoacoustic (SAG) neurônios. Inervação órgão sensorial depende de uma combinação de pistas de orientação axônio 1 e fatores de sobrevivência duas localizadas ao longo da trajetória de axônios em crescimento e / ou dentro de seus alvos órgão sensorial. Por exemplo, interferência funcional com uma via clássica de sinalização de orientação do axônio, Semaforina-neuropilin, gerado misrouting de axônios ótica 3. Além disso, vários fatores de crescimento expressos nas metas sensoriais do ouvido interno, incluindo Neurotrofina-3 (NT-3) e Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), têm sido manipulados em animais transgênicos, mais uma vez levando a misrouting de axônios SAG 4. Essas mesmas moléculas promover a sobrevivência e crescimento de neuritos de neurônios SAG pinto in vitro 5,6. Aqui, descrevemos e demonstrar o método in vitro estamos atualmente ucantar para testar a capacidade de resposta do neurites SAG pinto de proteínas solúveis, incluindo morfogenes conhecido como o Wnts, bem como fatores de crescimento que são importantes para promover o crescimento SAG neurite e sobrevivência dos neurônios. Usando este sistema modelo, esperamos tirar conclusões sobre os efeitos que ligantes secretados podem exercer sobre a sobrevivência SAG neurônio e crescimento de neuritos. Explantes SAG são dissecados no dia embrionárias 4 (E4) e cultivadas em géis tridimensionais de colágeno sob condições sem soro por 24 horas. Primeiro, a capacidade de resposta neurite é testada por explantes de cultura suplementado com proteína-médio. Então, perguntar se fontes pontuais de ligantes secretada pode ter efeitos direcionais no crescimento de neuritos, são explantes co-cultivados com proteína revestido contas e ensaiadas para a capacidade do talão até localmente promovem ou inibem a conseqüência. Nós também incluímos uma demonstração da dissecção (protocolo modificado 7) e cultura de explantes E6 medula espinhal. Nósrotineiramente usam explantes medula espinhal para confirmar bioatividade das proteínas e proteína-embebido contas, e verificar as espécies reatividade cruzada com tecido de bico, nas condições mesma cultura como explantes SAG. Estes ensaios in vitro são convenientes para a rápida triagem para as moléculas que exercem tróficos (sobrevivência) ou trópico (direcional) efeitos sobre os neurônios SAG, especialmente antes de realizar estudos in vivo. Além disso, este método permite que o teste de moléculas individuais sob condições sem soro, com alta sobrevivência dos neurônios 8.

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Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

Demonstramos como dissecar e cultura pinto gânglio statoacoustic E4 e E6 explantes medula espinhal. Explantes são cultivados sob condições sem soro em gel de colágeno 3D por 24 horas. Neuritos resposta é testado com o meio do fator de crescimento suplementado com proteína e revestido contas.

Dissecção e Cultura do Gânglio pintainho Statoacoustic e Explantes da Medula Espinhal em géis de colágeno para Ensaios crescimento de neuritos

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Neurociência

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

A Unidade Funcional Motor na placa de cultura: Co-cultivo de explantes da Medula Espinhal e as células musculares

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Dissecção e Cultura do mouse e dopaminérgico do estriado explantes em três dimensões Ensaios matriz de colágeno

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Embrião de galinha Spinal Cord Protocolo Cultura Slice

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Spinal Cord Injury completo e Cérebro Dissection Protocolo para Wholemount Subsequente<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização em larval da lampreia de mar

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq Análise de Gene Expression Diferencial em electroporados Pintainho Embryonic Medular

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Um Processo de Implantação de uma Câmara Spinal para Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Criação de Imagens do Cordão do rato Spinal

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Isolamento e cultura de neurônios da medula espinhal de ratos neonatais

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Entrega intra-arterial de células-tronco neurais ao cérebro de ratos e ratos: aplicação à isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...