Name: dissection and culture of chick statoacoustic ganglion and spinal cord explants in collagen gels for neurite outgrowth assays
Uploaded: 2011-12-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health Grant RO1DC002756 och Purdue Research Foundation. Vi tackar Doris Wu och Wiese Chang för att få råd med experiment och Rodney McPhail för hjälp med figurer.

Recept Chick Ringers <table border="1"><tbody><tr><td> 7,2 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 0,23 g </td><td> CaCl 2 + 2H 2 O </td></tr><tr><td> 0,37 g </td><td> KCl </td></tr><tr><td> 0,115 g </td><td> Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 900 ml </td><td> Vatten (vävnadskulturer kvalitet) </td></tr></tbody></table> Obs: Justera pH till 7,4. Ta slutliga volymen till 1000 ml med vatten. 10X PBS <ta...

<ol>
	<li>Fekete, D. M., Campero, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+in+the+inner+ear.">Axon guidance in the inner ear.</a> Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).</li><li>Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+inner+ear+afferent+connections:+forming+primary+neurons+and+connecting+them+to+the+developing+sensory+epithelia.">Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia.</a> Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).</li><li>Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+conveys+semaphorin+and+VEGF+signaling+during+neural+and+cardiovascular+development.">Neuropilin-1 conveys semaphorin and VEGF signaling during neural and cardiovascular development.</a> Dev. Cell. 5 (1), 45-45 (2003).</li><li>Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NT-3+replacement+with+brain-derived+neurotrophic+factor+redirects+vestibular+nerve+fibers+to+the+cochlea.">NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea.</a> J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).</li><li>Avila, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+support+the+survival+and+neuritogenesis+response+of+developing+cochleovestibular+ganglion+neurons.">Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons.</a> Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).</li><li>Bianchi, L. M., Cohan, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+neurotrophins+and+CNTF+on+developing+statoacoustic+neurons:+comparison+with+an+otocyst-derived+factor.">Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor.</a> Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).</li><li>Juurlink, B. e. r. n. h. a. r. d. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+Spinal+Somatic+Motoneurons+in+Culture.">Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture.</a> Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).</li><li>Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnts+and+Wnt+inhibitors+do+not+influence+axon+outgrowth+from+chicken+statoacoustic+ganglion+neurons.">Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons.</a> Hear. Res. , (2011).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).</li><li>Bourikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+guides+commissural+axons+along+the+longitudinal+axis+of+the+spinal+cord.">Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord.</a> Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).</li><li>Charron, F., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+brain+wiring+functions+for+classical+morphogens:+a+role+as+graded+positional+cues+in+axon+guidance.">Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance.</a> Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).</li><li>Augsburger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons.">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).</li><li>Lyuksyutova, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior-posterior+guidance+of+commissural+axons+by+Wnt-frizzled+signaling.">Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling.</a> Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).</li></ol>

Vi presenterar en metod för att dissekera och kultur E4 SAG och E6 spinal explants sladd, från chick, under serumfritt förhållanden. Detta förfarande används idag i vårt labb för att studera effekterna av olika utsöndras ligander på SAG neuron överlevnad och neurite utväxt. Nya aspekter av detta protokoll omfattar användning av en serumfritt system för odling explants och användning av pärlor fuktad med tillväxtfaktorer för att studera effekter på SAG neurite utväxt. En pärla metod som liknar vår h...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> Utrustning </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissection mikroskop </td><td></td><td></td><td> Vi använder en Leica M80 stereomikroskop med brightfield bas belysning </td></tr><tr><td> Skjut varmare </td><td> CS &amp; E. </td><td></td><td> Kollagen polymerisation </td></tr><tr><td> Kyckling ägg inkubator </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C / 5% CO 2 fuktas cellodling inkubator </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissection Material </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard &amp;kopiera, belagda petriskål </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 24-och cellodling tallrik </td><td> Corning </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Dumont pincett </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.252-30 </td><td></td></tr><tr><td> # 55 Dumont tång </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.295-51 </td><td></td></tr><tr><td> Rostfritt stål dissekera stift </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26.002-10 </td><td> Embryo fastlåsning, fina dissektion </td></tr><tr><td> Moria perforerad sked </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10.370-17 </td><td> Embryo skörd / överföring </td></tr><tr><td> 200 l bred mun pipett tips </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 118-96R </td><td> Explantation överföra </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E4 och E6 ägg kyckling </td><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Chick Ringer-lösning </td><td></td><td></td><td> Embryo skörd </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264 </td><td> SAG dissektion </td></tr><tr><td> L15 medelstora </td><td> Sigma </td><td> L5520 </td><td> Ryggmärgen dissektion medelstora </td></tr><tr><td> Fostrets kalvserum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td> Ryggmärgen dissektion medelstora </td></tr><tr><td> Vannas Saxar </td><td> Världen precisionsinstrument </td><td> 501.778 </td><td> Ryggmärgen dissektion </td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kollagen förberedelse </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rat-tail kollagen typ I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354.249 </td><td> Explantation kultur </td></tr><tr><td> 10X PBS (steril) </td><td></td><td></td><td> Till Neutralize kollagen </td></tr><tr><td> 1N NaOH (steril) </td><td></td><td></td><td> För att neutralisera kollagen </td></tr><tr><td> Destillerat vatten (steril) </td><td></td><td></td><td> För att neutralisera kollagen </td></tr><tr><td> pH-indikator papper (6,0-8,1) </td><td> Whatman </td><td> 2629-990 </td><td> För att kontrollera kollagen pH </td></tr><tr><td> 15 ml koniska rör </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 818-PG </td><td></td></tr><tr><td> 500 l bred mun pipett tips </td><td> Dot Scientific Inc </td><td> 119-R100 </td><td> Att Pipettera kollagen </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Explantation kultur </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 medelstora </td><td> Sigma </td><td> D8437 </td><td> Explantation odlingsmedium </td></tr><tr><td> DESS en </td><td> Sigma </td><td> I2521 </td><td> Medium komplettera </tD&gt; </tr><tr><td> Penicillin-streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> Medium komplettera </td></tr><tr><td> CNTF (råtta) </td><td> Sigma </td><td> C3835 </td><td> Medium komplettera </td></tr><tr><td> NT-3 (mänskliga) </td><td> Sigma </td><td> N1905 </td><td> Medium komplettera </td></tr><tr><td> Renat mus Wnt5a </td><td> FoU-system </td><td> 645-WN-010 </td><td></td></tr><tr><td> Affi-gel Blå gel pärlor </td><td> Bio-Rad </td><td> 153-7302 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immunohistokemi </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td> Fixering </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> Sköljningar </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td><td> Blockerande lösningen </td></tr><tr><td> Natriumazide </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td> Blockerande lösningen </td></tr><tr><td> Kalvserum </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td><td> Blockerande lösningen </td></tr><tr><td> Monoklonal IgG2b anti-β tubulin 1 + II antikropp </td><td> Sigma </td><td> T8535 </td><td> Etiketter cell organ och neurites </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 get anti-mus IgG2 B-antikroppar </td><td> Invitrogen </td><td> A21141 </td><td> Upptäcker β tubulin antikropp </td></tr><tr><td> Teflon mikro spatel </td><td> VWR </td><td> 57949-033 </td><td> Släpp kollagen geler från brunn </td></tr></tbody></table>

dissection and culture of chick statoacoustic ganglion and spinal cord explants in collagen gels for neurite outgrowth assays

Den sensoriska organ kyckling innerörat är innerveras av den perifera processer statoacoustic ganglion (SAG) nervceller. Sinnesorgan innervation beror på en kombination av Axon vägledning signaler 1 och faktorer överlevnad 2 längs banan för växande axoner och / eller inom deras sinnesorgan mål. Till exempel genereras funktionella störningar med en klassisk axonet vägledning signalväg, semaphorin-neuropilin, misrouting av öron axoner 3. Även flera tillväxtfaktorer uttryck i sensoriska målen i innerörat, inklusive Neurotrophin-3 (NT-3) och Brain neurotrofa Factor (BDNF), har manipulerats i transgena djur, återigen leder till misrouting av SAG axoner 4. Samma molekyler främja både överlevnad och neurite utväxt av nervceller chick SAG in vitro 5,6. Här beskriver vi och visar in vitro metod vi nu usjunga för att testa att reagera chick SAG neurites att lösliga proteiner, inklusive kända morfogener som Wnts samt tillväxtfaktorer som är viktiga för att främja utväxt SAG neurite och neuron överlevnad. Med hjälp av detta modellsystem hoppas vi att dra slutsatser om de effekter som utsöndras ligander kan utöva på SAG neuron överlevnad och neurite utväxt. SAG explants är dissekeras på embryonala dag 4 (E4) och odlas i tredimensionella kollagen geler i serumfritt förhållanden i 24 timmar. För det första är neurite lyhördhet testas genom odling explants med protein kompletterat-medium. Sedan, för att fråga om punktkällor för utsöndras ligander kan ha riktat effekter på neurite utväxt är explants co-odlade med protein-belagda pärlor och analyserade för förmåga pärla att lokalt främja eller hämma utväxt. Vi inkluderar även en demonstration av dissektion (modifierad protokoll 7) och kultur av E6 ryggmärgen explants. Virutinmässigt använder ryggmärgen explants att bekräfta bioaktivitet av proteiner och protein-blöt pärlor, och att bekräfta arter korsreaktivitet med chick vävnad, under samma kultur villkor som SAG explants. Dessa in vitro-analyser är bekvämt för snabb screening av molekyler som utövar trofiska (överlevnad) eller tropiska (riktnings) effekter på SAG nervceller, speciellt innan du utför studier in vivo. Dessutom tillåter denna metod testning av individuella molekyler under serumfritt förhållanden, med hög neuron överlevnad 8.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays at JoVE.com

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

Vi visar hur du dissekera och kultur chick E4 statoacoustic ganglion och E6 spinal explants sladden. Explants odlas i serumfritt förhållanden i 3D kollagen geler i 24 timmar. Neurite lyhördhet testas med tillväxtfaktor-kompletterat medium och med protein-belagda pärlor.

Dissekering och kultur Chick Statoacoustic Ganglion och Spinal explants sladd i Collagen Gel för Neurite utväxt analyser

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

En funktionell Motor enhet i Kultur Dish: Co-kultur av ryggmärg Explantat och muskelceller

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Dissektion och kultur mus dopaminerga och Striatala Explantat i tredimensionella analyser kollagenmatris

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Kycklingembryo Spinal Cord skiva Kultur Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Dissection och Lateral Montering av Zebrafish embryon: Analys av ryggmärgs Utveckling

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Komplett ryggmärgsskada och Brain Dissection protokoll för Efterföljande Wholemount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i Larvernas havsnejonöga

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq analys av Differential genuttryck i elektro Chick embryonala Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Ett förfarande för att implantera en Spinal avdelningen för Längs<em&gt; In Vivo</em&gt; Avbildning av Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Ryggmärgsneurons isolering och kultur från neonatala möss

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arteriell leverans av neurala stamceller till råtta och mus hjärnan: Ansökan till cerebral ischemi

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...