Name: amide hydrogen/deuterium exchange &amp; maldi-tof mass spectrometry analysis of pak2 activation
Uploaded: 2011-11-26T14:00:00
Duration: 7 min 15 s
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Questo lavoro è supportato in parte dal National Institutes of Health di Grant GM-26738 (a JAT).

1. Pak2 attivazione <ol><li> Aggiungere l&#39;appropriato pre-testati quantità di caspasi 3-20 l di 12 mg / ml Pak2 nel buffer A (50 mM DTT mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, e 2 a pH 7,5) e incubare a 34 ° C per 30 min a pieno fendere e attivare Pak2. </li><li> Analizzare i prodotti di scissione mediante SDS-PAGE (10%) e Coommassie colorazione blu. </li><li> Aggiungere il Pak2 spaccati di attivazione del buffer B (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 15 mM MgCl 2, 10 mM ATP) a pH 7,5, in 20 microlitri di una concentrazione finale di 10 mg / ml Pak2, e incubare a 34 ° C per 30 minuti per attivare completamente Pak2 da autofosforilazione a 8 siti. </li><li> Conferma scissione completa di Pak2 dalla migrazione dei frammenti p34 e p27 come determinato dalla SDS-PAGE 10. Un&#39;adeguata verifica delle condizioni autofosforilazione avviene tramite autoradiografia in un esperimento separato con (32 P) ATP o spettrometria di massa per rilevare fosfopeptidi. </li></ol> 2. Identificazionedi pepsina-digerito Pak2 Frammenti <ol><li> Aggiungere 1 ml di 0,1% Acido Trifluroacetic (TFA) a pH 2,5 a lavare le perline agarosio due volte prima dell&#39;uso. Poi, centrifugare i campioni per 15 sec a 2.000 xg per rimuovere le perline. </li><li> Aggiungi Pak2 (20 mg in 2 ml di 150 mM NaCl, 50 mM DTT mM Tris-HCl e 2 a pH 7,5) a 100 ml di 0,1% TFA, e incubare il campione per 5 minuti con 30 ml di pepsina-coniugato perline agarosio . </li><li> Equilibrare una inversione di fase colonna HPLC C18 con un sistema primario di solvente 0,1% TFA a pH 2.5. Il digest pepsina (50 ml) viene eluito con un lineare da 100 min gradiente di 0-80% acetonitrile contenente 0,1% TFA ad un flusso di 0,2 ml / min. Le frazioni vengono raccolti ogni 2 min. </li><li> Asciugare le frazioni HPLC con uno speed-vac (3 h) e risospendere i campioni in una soluzione di acetonitrile (5 mL) e lo 0,1% TFA (5 mL) a pH 2.5. </li><li> Inizialmente, ogni frazione è a screening per peptidi con il MALDI-TOF PerSeptive Biosystems Voyager DE STR (PE Biosystems, Foster City, CA, USA). </li><li> Le 16 frazioni contenenti peptidi sono sottoposti a spettrometria di massa tandem con un Q-TOF spettrometro di massa e un QSTAR XL oMALDI MS / MS per identificare i frammenti. </li><li> La sequenza di ciascun peptide è verificata dagli ioni prodotto generato dalla spettrometria di massa tandem con il teorico m / z coefficienti basati sulla sequenza principale del Pak2 Usando il sito web Protein Prospector ( <a href="http://prospector.ucsf.edu/">http://prospector.ucsf.edu/</a> ) 11. </li></ol> 3. Misura della Amide H / D Cambio <ol><li> Tenere tutte le soluzioni e reagenti necessari per H / D cambio a 25 ° C a bagnomaria. ATP viene disciolto in acqua e il pH è regolato a 7,0 prima dell&#39;uso. L&#39;ulteriore 4mm ATP in D 2 O buffer è di impedire ATP dissociato dal Pak2 dopo la diluizione. </li><li> Avviare H / D scambio con l&#39;aggiunta di 18 ml di tampone D 2 O (50 mM MOPS pH 6,98, 125 mM NaCl) a 2 microlitri (20 mcg) Di Pak2 in un tampone contenente 150 mM NaCl, 50 mM mM Tris-HCl (pH 7,5) e 2 DTT, che comporti un livello Pak2 di 10 mg / ml e un pH di 7,0 a 0 ° C. </li><li> Incubare i campioni in triplice copia in H / D cambio di 0, 0,5, 1, 3, 5 e 10 minuti, o 24 ore </li><li> Estinguere la H / D processo di scambio con l&#39;aggiunta di 180 ml di ghiacciata TFA 0,1% a pH 2.2, che porta il pH a 2,5 in un volume finale di 200 l. Per i campioni contenenti ATP, 180 ml di ghiacciata TFA 0,11% a pH 2.2 è utilizzato per mantenere il pH a 2,5 in stato bonificato. </li><li> Aggiungere un&#39;aliquota (100 l) di ciascun campione spento a 30 ml di pepsina attivata coniugato perline agarosio. La digestione pepsina è autorizzato a procedere su ghiaccio per cinque minuti ed i campioni sono in agitazione ogni 30 sec. </li><li> Terminare la digestione per centrifugazione del campione per 15 sec a 5.000 xga 4 ° C per rimuovere la pepsina. </li><li> Congelare rapidamente i campioni in liquido N 2 e conservare a -80 ° C per non più di 2giorni prima della MALDI-TOF analisi. </li><li> La matrice di MALDI è di 5 mg / ml di α-ciano-4-idrossicinnamici acido (CHCA) disciolto in una soluzione (1:1:1) di acetonitrile, etanolo e 0,1% TFA a pH 2,5 e tenuto a 0 ° C. </li><li> Parzialmente scongelare rapidamente ogni campione e mescolare 1 ml di ogni campione con 1 l di matrice e spot su un 4 ° C Piastra MALDI. </li><li> Applicare un vuoto moderato al piatto ad asciugare i punti in 30 secondi prima di MALDI-TOF analisi. Il tempo tra scongelamento del campione e il recupero dello spettro è di circa 3 min. </li><li> Acquisire MALDI-TOF spettri di massa con un PerSeptive STR Biosystems Voyager DE. Acquisire dati in un 2-GHz, frequenza di campionamento a 100.000 canali di dati, con un 20.000 V tensione di accelerazione, e una tensione di rete del 65% utilizzando l&#39;estrazione con un ritardo di 180 ns ritardo impulsi. Un centinaio di scansioni sono in media di 2 min. Il MALDI-TOF strumento non si limita a qualsiasi marca o software particolari. </li><li> Utilizzare il programma per computer Data Explorer 4.0 per calculmangiato la deuterazione di ogni frammento. </li><li> Calcolare il cambio posteriore in base al rapporto del numero effettivo deuterone incorporata a 24 ore di H / D cambio divisa per tutti i siti possibili intercambiabili, che sono la spina dorsale amidi, tranne N-terminale ammide (Figura 1). </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: La scissione della caspasi e autofosforilazione sono verificati mediante SDS-PAGE colorazione Commassie. Pak2 inattive è una singola banda di 58 kDa. Scissione della caspasi Pak2 è completa, e produce due frammenti, p27 e p34 che migrano separatamente. La migrazione di autophosphorylated p27 e p34 mostra una sovrapposizione sul gel a causa della ritardata migrazione del frammento completamente fosforilati p27 (Figura 2). H / D esperimenti di cambio vengono effettuate più volte tra 0 e 10 min (Figura 3). A titolo di esempio, la durata d&#39;incorporazione deuterio in m / ZPEAK 1697,85 di Pak2 inattivi è composto da più picchi isotopici, come indicato dallo spostamento della busta di massa nel corso del tempo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig1.jpg" /> Figura 1. Equazione per il calcolo del deuterazione. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig2.jpg" /> Figura 2. Autofosforilazione e scissione delle caspasi Pak2. Caspasi-spaccati Pak2 (corsia di sinistra), intatto Pak2 inattiva (corsia centrale) e della caspasi-spaccati autophosphorylated Pak2 (corsia di destra) sono stati analizzati mediante SDS-PAGE e Coommassie colorazione blu. Adattato da Hsu, YH et al 2. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig3.jpg" /> Figura 3. Spettro di massa di un corso momento della costituzione di deuterio per Pak2 inattivi. Pak2 inattivo è stato sottoposto a H / D SCAMBIOESN per 0-10 min e analizzati da MALDI-TOF. Un esempio della distribuzione isotopica del ampliato MALDI-TOF di picco m / z 1697,85 durante il periodo di tempo di H / D scambio è mostrato. La linea rossa tratteggiata indica la media della busta di massa e lo spostamento della busta di massa mostra il deuterazione di un peptide.

<ol>
	<li>Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amide+H/2H+exchange+reveals+communication+between+the+cAMP+and+catalytic+subunit-binding+sites+in+the+R(I)alpha+subunit+of+protein+kinase.">Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase.</a> A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).</li><li>Hsu, Y. H., Johnson, D. A., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+conformational+changes+during+activation+of+protein+kinase+Pak2+by+amide+hydrogen/deuterium+exchange.">Analysis of conformational changes during activation of protein kinase Pak2 by amide hydrogen/deuterium exchange.</a> J. Biol. Chem. 283, 36397-36405 (2008).</li><li>Englander, S. W., Kallenbach, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+exchange+and+structural+dynamics+of+proteins+and+nucleic+acids.">Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids.</a> Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).</li><li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry.">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass. Spectrom. 5, 214-217 (1991).</li><li>Dennis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localizing+the+membrane+binding+region+of+Group+VIA+Ca2+-independent+phospholipase+A2+using+peptide+amide+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Localizing the membrane binding region of Group VIA Ca2+-independent phospholipase A2 using peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 284, 23652-23661 (2009).</li><li>Hsu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+rigidifies+the+C2+domain+and+the+intradomain+interaction+of+GIVA+phospholipase+A2+as+revealed+by+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).</li><li>Lee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+hPAK65+by+caspase+cleavage+induces+some+of+the+morphological+and+biochemical+changes+of+apoptosis.">Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).</li><li>Rudel, T., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+and+morphological+changes+in+apoptotic+cells+regulated+by+caspase-mediated+activation+of+PAK2.">Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2.</a> Science. 276, 1571-1574 (1997).</li><li>Roig, J., Traugh, J. 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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Identificazione della pepsina-digerito Frammenti è un passo fondamentale della H / D esperimento di scambio. Identificazione errata del peptide può condurre a conclusioni errate. Pak2 pepsina-digerito viene eluito in una colonna HPLC in fase inversa C18 per ottenere un fondo pulito. Nei nostri esperimenti, un totale di 40 frazioni sono state raccolte e sottoposte a MALDI-TOF. Peptidi multipli potrebbero essere identificati in ciascuna delle frazioni. I peptidi sono stati sottoposti a spettrometria di massa tandem (Q-TOF MS / MS e oMALDI MS / MS) per identificare le loro sequenze. La MS / MS spettri di un peptide dovrebbe avere almeno tre ioni prodotto per confermare l&#39;identificazione del peptide. Il programma per computer Data Explorer 4.0 (Applied Biosystems) esegue la correzione iniziale di base e filtraggio del rumore. Ogni spettro deve essere calibrata sulla base di due picchi in sequenza. Noi calibrare il nostro spettro da parte della massa teorica del undeuterated m / z che sono 923,45 e 1697,84. Tlui accuratezza di massa dopo la calibrazione può raggiungere i 10 ppm. Su deuterazione, il mono-isotopo può passare ad una massa maggiore. Aumenta passo unitario a questi m / z rapporti ceduto le masse associate a una maggiore deuterazione. L&#39;intensità dei picchi della busta di massa non influisce sul livello deuterazione. Tuttavia, l&#39;intensità dei picchi dei picchi isotopici in una busta di massa particolare sono fondamentali per il calcolo della massa media. Il primo passo del calcolo del deutone è incorporato sottraendo la massa del peptide non deuterati campione dal campione deuterato. Tre altri fattori, la diluizione D 2 O, il deuteroni residuo nelle catene laterali e il cambio posteriore, dovranno essere ulteriormente considerati nel calcolo (Figura 1). La diluizione D 2 O è il fattore di diluizione D 2 O dopo la miscelazione del campione e D 2 O di buffer di avviare la H / D cambio. Deutone residua (4,5%) nelle catene laterali della pepsina-digerirepeptidi ed ha bisogno di essere sottratto. Il back-scambio è l&#39;inevitabile perdita di deuterazione in tutti i peptidi deuterato e pepsina-digerito nel processo di misura di massa. Il peptide più accessibile solvente (m / z = 1105,60) dopo 24 ore di H / D cambio rappresenta una regione ricca deuterazione. Il numero deuterone incorporato per ciascuno dei peptidi è la differenza tra il baricentro dei peptidi deuterati e non deuterati peptica Pak2. Il più grande deuterati peptide m / z 1105 è stato selezionato per rappresentare deuterazione piena quando Pak2 era a 24 ore di H / D cambio. Il Rapporto di Cambio posteriore è stato calcolato il numero effettivo deuterone incorporata a 24 ore di H / D cambio divisa per tutti i siti possibili scambiabile a peptide m / z 1105.

<table border="1"></table><table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> Aldrich </td><td> 7789-20-0 </td><td></td></tr><tr><td> α-ciano-4-acido idrossicinnamici </td><td> Sigma </td><td> 28166-41-8 </td><td></td></tr><tr><td> MALDI-TOF </td><td> PE Biosystems </td><td> Voyager DE STR </td><td></td></tr><tr><td> Q-TOF Spettrometro di massa </td><td> Q-TOF Ultima-Global </td><td></td><td></td></tr><tr><td> QSTAR XL oMALDI MS / MS </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dati Explorer 4.0 programma per computer </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tr&gt; </tbody></table>

amide hydrogen/deuterium exchange &amp; maldi-tof mass spectrometry analysis of pak2 activation

Ammide idrogeno / deuterio scambio (H / D cambio) accoppiata a spettrometria di massa è stata ampiamente utilizzata per analizzare l&#39;interfaccia di interazioni proteina-proteina, i cambiamenti conformazionali delle proteine, la dinamica delle proteine ​​e le interazioni proteina-ligando. H / D cambio sulle posizioni ammidico la spina dorsale è stata utilizzata per misurare i tassi deuterazione delle micro-regioni di una proteina mediante spettrometria di massa 1,2,3. La risoluzione di questo metodo dipende dalla digestione pepsina deuterati della proteina di interesse in peptidi che normalmente gamma 3-20 residui. Anche se la risoluzione di H / D cambio misurato mediante spettrometria di massa è inferiore alla risoluzione singolo residuo misurata dal eteronucleari singola coerenza quantistica (HSQC) metodo di NMR, la misurazione della spettrometria di massa in H / D cambio non è limitata dalla dimensione del proteine ​​4. H / D lo scambio avviene in soluzione acquosa che mantiene la conformazione delle proteine. Mettiamo a disposizione un metodo che utilIZES il MALDI-TOF per la rilevazione di 2, al posto di un HPLC / ESI (ionizzazione electrospray)-MS sistema di 5,6. Il MALDI-TOF fornisce dati accurati intensità di massa per i peptidi della proteina digerita, in questo caso Pak2 proteina chinasi (detta anche γ-Pak). Proteolisi di Pak 2 è effettuato in una digestione pepsina non in linea. Questo metodo alternativo, quando l&#39;utente non ha accesso a una colonna HPLC e pepsina collegato alla spettrometria di massa, o quando la colonna pepsina in HPLC non si traduca in una mappa digestione ottimale, per esempio, il pesante disolfuro-bonded secreto fosfolipasi A 2 (SPLA 2). Utilizzando questo metodo, abbiamo monitorato con successo i cambiamenti nel livello deuterazione durante l&#39;attivazione della caspasi 3 Pak2 di scissione e autofosforilazione 7,8,9.

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Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

MALDI-TOF spettrometria di massa è stato utilizzato con successo per monitorare la amide idrogeno / deuterio in cambio di attivazione della proteina chinasi Pak2.

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