Name: amide hydrogen/deuterium exchange &amp; maldi-tof mass spectrometry analysis of pak2 activation
Uploaded: 2011-11-26T14:00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation at JoVE.com

Detta arbete stöds delvis från National Institutes of Health Grant GM-26.738 (till JAT).

1. Pak2 Aktivering <ol><li> Lägg till lämpliga prekliniska testade mängd caspase 3 till 20 l på 12 mg / ml Pak2 i buffert A (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, och 2 mm DTT vid pH 7,5) och inkubera vid 34 ° C i 30 min att till fullo klyva och aktivera Pak2. </li><li> Analysera sönderdelningsprodukterna av SDS-PAGE (10%) och Coommassie blå färgning. </li><li> Lägg till klyvs Pak2 till aktivering buffert B (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 15 mM MgCl 2, 10 mm ATP) vid pH 7,5, i 20 l till en slutlig koncentration på 10 mg / ml Pak2, och inkubera vid 34 ° C i 30 min för att fullt ut aktivera Pak2 av autophosphorylation på 8 platser. </li><li> Bekräfta fullt klyvning av Pak2 av migration av P34 och P27 fragment som bestäms av SDS-PAGE 10. Korrekt kontroll av de autophosphorylation villkor görs via autoradiografi i ett separat experiment med (32 P) ATP eller masspektrometri för att upptäcka phosphopeptides. </li></ol> 2. Identifikationpepsin-Digested Pak2 Fragment <ol><li> Tillsätt 1 ml 0,1% Trifluroacetic Acid (TFA) vid pH 2,5 för att tvätta agaros pärlor två gånger före användning. Sedan centrifugera proverna i 15 sek vid 2000 xg för att ta bort kulorna. </li><li> Lägg Pak2 (20 mikrogram i 2 ìl 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl och 2 mm DTT vid pH 7,5) till 100 l på 0,1% TFA, och inkubera provet i 5 minuter med 30 l pepsin-konjugerad agaros pärlor . </li><li> Jämvikta en omvänd fas HPLC-C18 kolonn med en primär lösningsmedel system med 0,1% TFA vid pH 2,5. Pepsinet digest (50 l) elueras hjälp av en linjär 100-min lutning på 0 - 80% acetonitril som innehåller 0,1% TFA med en flödeshastighet av 0,2 ml / min. Bråk samlas varje 2 min. </li><li> Torka HPLC fraktioner med en hastighet-Vac (3 h) och återsuspendera proverna i en lösning av acetonitril (5 l) och 0,1% TFA (5 l) vid pH 2,5. </li><li> Inledningsvis är varje fraktion screenas för peptider med hjälp av MALDI-TOF-PerSeptive Biosystems Voyager DE STR (PE Biosystems, Foster City, CA, USA). </li><li> Den 16 fraktioner som innehåller peptider utsätts för tandem masspektrometri med en Q-TOF masspektrometer och en QSTAR XL oMALDI MS / MS för att identifiera fragment. </li><li> Sekvensen av varje peptid verifieras av den produkt joner genereras av tandem masspektrometri med de teoretiska m / z beräknade på den primära sekvens av Pak2 använda Protein Prospector webbplats ( <a href="http://prospector.ucsf.edu/">http://prospector.ucsf.edu/</a> ) 11. </li></ol> 3. Mätning av amid H / D Exchange <ol><li> Håll alla lösningar och reagenser som behövs för H / D utbyte vid 25 ° C i ett vattenbad. ATP är upplöst i vatten och pH-värdet justeras till 7,0 före användning. De extra 4mm ATP i D 2 O buffert är att förhindra ATP skiljas från Pak2 efter utspädning. </li><li> Initiera H / D utbyte genom tillsats av 18 ìl av buffrad D 2 O (50 mm MOPS pH 6,98, 125 mM NaCl) till 2 l (20 mikrogram) Av Pak2 i en buffert innehållande 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) och 2 mm DTT, vilket resulterar i en Pak2 nivå på 10 mg / ml och ett pH 7,0 vid 0 ° C. </li><li> Inkubera proverna i tre exemplar på H / D utbyte mot 0, 0,5, 1, 3, 5 och 10 min eller 24 h. </li><li> Släck H / D-processen genom att tillsätta 180 l iskallt 0,1% TFA vid pH 2,2, vilket innebär att pH-värdet till 2,5 i en slutlig volym på 200 l. För de prover som innehåller ATP, 180 l iskallt 0,11% TFA vid pH 2,2 används för att hålla pH-värdet 2,5 i kylda skick. </li><li> Lägg till en alikvot (100 l) för varje kylda prov till 30 l av aktivt pepsin-konjugerade agaros pärlor. Pepsinet matsmältningen är tillåtet att gå vidare på is i fem minuter och proverna vortexed var 30 sek. </li><li> Avsluta matsmältningen genom centrifugering av provet i 15 sek vid 5000 xg vid 4 ° C för att ta bort pepsin. </li><li> Snabbt frysa proverna i flytande N 2 och förvara vid -80 ° C i högst 2dagar före MALDI-TOF-analys. </li><li> Matrisen för MALDI är 5 mg / ml α-cyano-4-hydroxycinnamic syra (CHCA) upplöses i en lösning (1:1:1) acetonitril, etanol och 0,1% TFA vid pH 2,5 och hållas vid 0 ° C. </li><li> Delvis tina varje prov snabbt och blanda 1 l av varje prov med 1 ìl matrix och plats på ett 4 ° C MALDI måltavla. </li><li> Applicera ett måttligt vakuum för att plattan torka fläckarna i 30 sek innan MALDI-TOF-analys. Tiden mellan upptining av provet och spektrum hämtning är ca 3 min. </li><li> Förvärva MALDI-TOF mass spektra med en PerSeptive Biosystems Voyager DE STR. Få uppgifter på en 2-GHz samplingshastighet på 100 tusen uppgifter kanaler, med en 20 tusen-V accelerationsspänning, och en 65% nätspänning med fördröjd extraktion med en 180-ns puls fördröjning. Hundra genomsökningar genomsnitt i 2 min. MALDI-TOF-instrument är inte begränsad till någon märke eller någon särskild programvara. </li><li> Använd Data Explorer 4,0 datorprogram för calculåt deuteration av varje fragment. </li><li> Beräkna tillbaka utbyte baserat på förhållandet mellan de ingående faktiska deuteronen antalet till 24 timmar av H / D utbyte dividerat med alla möjliga utbytbara webbplatser, som utgör ryggraden amider utom N-terminal amid (Figur 1). </li></ol> 4. Representativa resultat: Den caspase klyvning och autophosphorylation verifieras av SDS-PAGE Commassie färgning. Inaktiv Pak2 är ett enda band av 58 kDa. Caspase klyvning av Pak2 är klar, och producerar två fragment, P27 och P34 som vandrar separat. Migreringen av autophosphorylated P27 och P34 visar en överlappning på gelen på grund av den efterblivna migration av helt fosforyleras p27 fragment (Figur 2). H / D utbyte experimenten utförs flera gånger mellan 0 och 10 min (Figur 3). Som ett exempel, den tid under deuterium införlivas i m / ZPEAK 1697,85 inaktiva Pak2 består av flera isotopiska toppar vilket framgår av förskjutning av massan kuvertet med tiden. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig1.jpg" /> Figur 1. Ekvation för beräkning av deuteration. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig2.jpg" /> Figur 2. Autophosphorylation och caspase klyvning av Pak2. Caspase-klyvs Pak2 (vänster körfält), intakt inaktiva Pak2 (mitten körfältet) och caspase-klyvs autophosphorylated Pak2 (höger körfält) analyserades av SDS-PAGE och Coommassie blå färgning. Anpassad från Hsu, YH et al 2. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig3.jpg" /> Figur 3. Masspektrum om en tid under deuterium bolagsordning för inaktiva Pak2. Inaktiva Pak2 utsattes för H / D exchaNBE för 0-10 min och analyseras av MALDI-TOF. Ett exempel på den utvidgade isotopiska fördelningen av MALDI-TOF av topp m / z 1697,85 under tiden loppet av H / D utbyte visas. Den röda streckade linjen visar den genomsnittliga massan kuvert och förskjutningen av massan kuvertet visar deuteration av en peptid.

<ol>
	<li>Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amide+H/2H+exchange+reveals+communication+between+the+cAMP+and+catalytic+subunit-binding+sites+in+the+R(I)alpha+subunit+of+protein+kinase.">Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase.</a> A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).</li><li>Hsu, Y. H., Johnson, D. A., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+conformational+changes+during+activation+of+protein+kinase+Pak2+by+amide+hydrogen/deuterium+exchange.">Analysis of conformational changes during activation of protein kinase Pak2 by amide hydrogen/deuterium exchange.</a> J. Biol. Chem. 283, 36397-36405 (2008).</li><li>Englander, S. W., Kallenbach, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+exchange+and+structural+dynamics+of+proteins+and+nucleic+acids.">Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids.</a> Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).</li><li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry.">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass. Spectrom. 5, 214-217 (1991).</li><li>Dennis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localizing+the+membrane+binding+region+of+Group+VIA+Ca2+-independent+phospholipase+A2+using+peptide+amide+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Localizing the membrane binding region of Group VIA Ca2+-independent phospholipase A2 using peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 284, 23652-23661 (2009).</li><li>Hsu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+rigidifies+the+C2+domain+and+the+intradomain+interaction+of+GIVA+phospholipase+A2+as+revealed+by+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).</li><li>Lee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+hPAK65+by+caspase+cleavage+induces+some+of+the+morphological+and+biochemical+changes+of+apoptosis.">Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).</li><li>Rudel, T., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+and+morphological+changes+in+apoptotic+cells+regulated+by+caspase-mediated+activation+of+PAK2.">Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2.</a> Science. 276, 1571-1574 (1997).</li><li>Roig, J., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytostatic+p21+G+protein-activated+protein+kinase+gamma-PAK.">Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK.</a> Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).</li><li>Walter, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+and+activation+of+p21-activated+protein+kinase+gamma-PAK+by+CPP32+(caspase+3).+Effects+of+autophosphorylation+on+activity.">Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity.</a> J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).</li><li>Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+accurate+mass+measurement+(+/-+10+ppm)+in+protein+identification+strategies+employing+MS+or+MS/MS+and+database+searching.">Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching.</a> Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Identifiering av Pepsin-Digested Fragment är ett kritiskt steg i H / D utbyte experiment. Felaktig identifiering av peptiden kan leda till en felaktig slutsats. Pepsin-smält Pak2 elueras genom en omvänd fas HPLC-C18 kolonn för att få en ren bakgrund. I våra experiment, totalt 40 fraktioner som samlas in och utsättas för MALDI-TOF. Flera peptider kunde identifieras i varje bråk. De peptider utsattes för tandem masspektrometri (Q-TOF MS / MS och oMALDI MS / MS) för att identifiera sina sekvenser. MS / MS spektra av en peptid bör ha minst tre produktområden joner för att bekräfta identifieringen av peptiden. Data Explorer 4,0 datorprogram (Applied Biosystems) utför den initiala baslinjekorrigering och buller filtrering. Varje spektrum måste kalibreras på två sekvenseras toppar. Vi kalibrerar våra spektrum av teoretiska massa undeuterated m / z som är 923,45 och 1697,84. Than massa noggrannhet efter kalibrering kan nå 10 ppm. Vid deuteration kan mono-isotopen skift till en högre massa. Unitary steg ökar till dessa m / z förhållande gav det utökade massorna i samband med deuteration. Den högsta intensitet massan kuvertet kommer inte att påverka deuteration nivå. Men toppen intensiteten hos isotopiska toppar i en viss massa kuvert är kritiska för beräkning av den genomsnittliga vikten. Det första steget i beräkningen av ingående deuteronen är att subtrahera peptid massan av icke-deuterated provet från deuterated provet. Tre andra faktorer, D 2 O utspädning, kvarvarande deuteroner i sidan kedjor och baksidan utbyte, kommer att behöva övervägas ytterligare i beräkningen (Figur 1). D 2 O är den utspädning faktor D 2 O efter blandning provet och D 2 O buffert att inleda H / D utbyte. Den återstående deuteronen (4,5%) i sidokedjor av pepsinet-digestED peptider måste subtraheras. Back-utbyte är den oundvikliga förlusten av deuteration i alla deuterated och pepsin-smälta peptider i massan mätningen. Den mest solida tillgängliga peptid (m / z = 1105,60) efter 24-timmars för H / D utbyte representerar en hel deuteration regionen. Det ingår deuteronen nummer för varje peptider är skillnaden mellan tyngdpunkten för deuterated och icke-deuterated Pak2 peptiskt peptider. Den mest deuterated peptid m / z 1105 valdes att representera hela deuteration när Pak2 var på 24 timmar av H / D utbyte. The Back Utbytesrelationen beräknades genom de inbyggda faktiska deuteronen antalet till 24 timmar av H / D utbyte dividerat med alla möjliga utbytbara platser vid peptid m / z 1105.

<table border="1"></table><table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> Aldrich </td><td> 7789-20-0 </td><td></td></tr><tr><td> α-cyano-4-hydroxycinnamic syra </td><td> Sigma </td><td> 28166-41-8 </td><td></td></tr><tr><td> MALDI-TOF- </td><td> PE Biosystems </td><td> Voyager DE STR </td><td></td></tr><tr><td> Q-TOF masspektrometer </td><td> Q-TOF Ultima-Global </td><td></td><td></td></tr><tr><td> QSTAR XL oMALDI MS / MS </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Data Explorer 4,0 datorprogram </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tr&gt; </tbody></table>

amide hydrogen/deuterium exchange &amp; maldi-tof mass spectrometry analysis of pak2 activation

Amid väte / deuterium utbyte (H / D utbyte) i kombination med masspektrometri har i stor utsträckning använts för att analysera gränssnittet av protein-protein interaktioner, protein konformationsändringar, dynamik protein och protein-ligand interaktioner. H / D utbyte på de positioner ryggraden amid har använts för att mäta deuteration satserna i mikroregioner i ett protein genom masspektrometri 1,2,3. Upplösningen av denna metod beror på pepsin matsmältningen av deuterated proteinet av intresse i peptider som kan variera från 3 till 20 rester. Även om upplösningen av H / D utbyte mätt med masspektrometri är lägre än den enstaka restsubstanser upplösningen mätt som heteronukleär Single Quantum konsekvens (HSQC) metod för NMR, masspektrometri mätningen i H / D växeln inte begränsas av storleken på protein 4. H / D utbyte sker i en vattenlösning som upprätthåller protein konformation. Vi erbjuder en metod som utilizes MALDI-TOF för upptäckt 2, i stället för en HPLC / ESI (elektrospray jonisering)-MS-systemet 5,6. MALDI-TOF ger korrekta uppgifter massa intensitet för peptider av smälta proteinet, i detta fall proteinkinas Pak2 (även kallad γ-Pak). Proteolys av Pak 2 sker i en offline pepsin matsmältningen. Denna alternativa metod, när användaren inte har tillgång till en HPLC och pepsin kolonnen kopplad till masspektrometri, eller när pepsinet kolumnen HPLC inte resultera i en optimal matsmältning karta, till exempel kraftigt disulfide bundna utsöndras fosfolipas A 2 (SPLA 2). Med hjälp av denna metod, övervakas vi framgångsrikt förändringar i deuteration nivå under aktivering av Pak2 av caspase 3 klyvning och autophosphorylation 7,8,9.

Watch this Scientific Journal Video about Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation at JoVE.com

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

MALDI-TOF masspektrometri har framgångsrikt använts för att övervaka amid-väte / deuterium utbyte i proteinkinas Pak2 aktivering.

Amid Hydrogen / Deuterium Exchange och MALDI-TOF-masspektometri Analys av Pak2 Aktivering

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Research

JoVE Journal

Biology

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Provberedning: Ultra tunt lager Metod

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Analysera stora proteinkomplex från struktur-masspektrometri

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

T-vågen Ion Mobility-masspektrometri: Grundläggande experimentell Rutiner för Protein Komplex analys

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Direkt analys av enskilda celler med masspektrometri vid atmosfärstryck

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Profilering Tiol Redox Proteome Användning Isotope spektrometri Taggning Mäss

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA)

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment Kartchner Caverns, AZ, USA

Användning av MALDI-TOF-masspektometri och en anpassad Databas för att karaktärisera Bakterier ursprungsfolk till en unik grotta Miljö (Kartchner Caverns, AZ, USA)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Vald Reaction Monitoring masspektrometri för Absolute protein kvantifiering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Anrikning av extracellulära matrixproteiner från vävnader och matsmältning i peptider för masspektrometri analys

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Tillämpningar av Single-sonden: masspektrometri Imaging och Single cellanalys under normala förhållanden

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Komplett arbetsflöde för analys av Histon posttranslationella modifieringar med botten upp masspektrometri: Från Histon Extraction till dataanalys

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...