Name: in vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina
Uploaded: 2011-12-27T12:00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina at JoVE.com

فإن الكتاب أود أن أشكر الحياة Freimann مركز العلوم ومركز البحوث للموظفين اسماك الزرد لرعايتهم والحفاظ على الزرد.

1. Morpholino التحضير : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي لجميع oligos morpholino يكون مصمما خصيصا وأمرت خلال GeneTools (Philomath ، OR). نستخدم المشحون إيجابيا lissamine الموسومة morpholinos لدفع morpholinos electroporated نحو القطب السالب. حاولنا ، دون جدوى ، لاستهداف المشحونة سلبا فلوريسئين الموسومة morpholinos إلى القطب الموجب باستخدام هذه التقنية. تمييع nmol 300 إلى 100 من morpholino ميكرولتر من nuclease خالية من المياه لانتاج حل 3 مم. قسامة في morpholino إلى عدة أنابيب microcentrifuge البارافين مختومة. تخزين بعيدا عن الضوء في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز morpholino بواسطة تمييع 5 ميكرولتر من morpholino (أو المياه المستخدمة لتخفيف morpholino باعتبارها فارغة) في 95 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك N 0.1. ضبط معمل الطول الموجي (λ) إلى 265 نانومتر. حساب ثابت لmorpholino باستخدام المعادلة التالية : ثابت = الوزن الجزيئي خاص لmorpholin الخاصس X 1000/molar الامتصاصية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوف تجد الوزن الجزيئي والبيانات الامتصاصية المولي على ورقة &quot;أليغو خصائص&quot; المتوفرة مع كل morpholino. تحليل فارغة للتحقق من القراءات قراءات أساسية واتخاذ كل morpholino المخفف. مضاعفة الامتصاصية في 265 نانومتر كل morpholino التي تحدد ثابتها وعامل إضعاف للحصول على التركيز في ميكروليتر / نغ. تقسيم هذا العدد من الوزن الجزيئي لتحديد التركيز في مم. تمييع morpholino ، إذا لزم الأمر ، إلى تركيز العمل. </li></ol> 2. إزالة الطبقة القرنية الخارجي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير 12/06 الزرد البالغين من العمر في الشهر Tricaine أو 2 ملغ في phenoxyethanol - 1.0 / مل في مياه الصهاريج الزرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مبلل التفاف الزرد في قطعة من منشفة ورقية ، يغطي الخياشيم ، ولكن ترك العين تتعرض لها. يوضع السمك ملفوفة تحت المجسام ويتم زيادة التكبير حتى قطره من العين يملأ ما يقرب من ثلثالمجال البصري (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام دومون # 5 ملاقط ، والاستيلاء على القرنية الخارجي بالقرب من الشق البصري. وهذا النسيج الملون باللون الأحمر ، والمسمى &quot;OC&quot; في الشكل 1. هناك نتوء بسيط أو الشفة المشار إليها بواسطة السهم المسمى &quot;CL&quot;. سحب بزاوية منخفضة (أي 10 درجة) في جميع أنحاء العين لإزالة القرنية الخارجي. مع الممارسة ، ويمكن الانتهاء من هذا في اقتراح واحد. إذا كانت زلة ملاقط ، وإعادة الاستيلاء على الأنسجة وسحب مرة أخرى في زاوية منخفضة حتى إزالتها. ويمكن للقرنية جيدا المرفقة يؤدي إلى طرد العين من مأخذ عندما انسحبت. يمكنك إبقاء العين من أن تصبح طردتهم مستقرا مع مجموعة أخرى من ملاقط. </li></ol> 3. شق القرنية والحقن morpholino : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد إزالة القرنية الخارجي ، وجعل شق صغير في القرنية حيث يلتقي التلميذ القزحية (الشكل 2). يتم ذلك باستخدام شفرة مشرط الياقوت (انظر المواد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 0.5 ميكروليتر من محلول 3.0 ملي morpholino الى Hamiltعلى حقنة مجهزة قياس 33 القابلة للإزالة ، كليلة نهاية الإبرة (انظر المواد). ماصة صعودا وهبوطا لإزالة فقاعات الهواء في السطر. إدراج بعناية الإبرة في الجسم الزجاجي من خلال شق (الشكل 2). لا يدخل الإبرة بعيدا أو سوف ثقب في الشبكية أو تهجير العدسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن ببطء الحل morpholino في الفضاء الزجاجية. اعتمادا على عمر السمكة ، فإن المساحة الزجاجية عقد ~ 0.5 ميكرولتر. يجب عليك تصور الزجاجي بغير لون تتسرب من شق كما هو النازحين من قبل حل morpholino. حتى حقن كمية صغيرة من التسريبات morpholino حل للخروج من شق. يجب أن تصور بوضوح morpholino lissamine الموسومة داخل العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحقن ، وعودة الأسماك إلى خزان للتعافي. نحن عادة حقن العين اليسرى فقط ، وذلك باستخدام العين اليمنى كعنصر تحكم uninjected ، ولكن في كلتا العينين electroporation هو ممكن. </li></ol> 4. Electroporation : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التاليضخ ما يقرب من 10 الأسماك ، وإعادة حقن تخدير سمكة والتفاف عليه في قطعة مبللة من منشفة ورقية ، وتغطي فقط الخياشيم ، ولكن ترك العين تتعرض لها. نقل السمك إلى طبق بتري. وضعت على قفازات اللاتكس أو مشابهة لتجنب التعرض للتخدير. أثناء الضغط بلطف الأسماك إلى قاع الطبق ، وملء الطبق مع تخدير (الشكل 3 ، لوحة على اليسار). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صفيحة البلاتين 3 ملم وقطره الكهربائي (راجع المواد) يموضع النبضات electroporation إلى نصف ما يقرب من شبكية العين. نحن الهدف عادة في الشبكية الظهرية. اضغط بلطف القطب الموجب النزولي في النصف بطني من العين. مع إزالة القرنية الخارجي ، واستدارة العين بسهولة ، ويعرض الجزء الظهري من مقلة العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين لا يزال الضغط باستمرار على الجانب البطني من العين ، ومكان بالقرب من القطب السالب (~ 1-2 ملم) في النصف يتعرض الظهرية من العين. يجب الحرص على عدم لمس القطب السالب مباشرة للعين ، والتي سوف تؤدي إلى الإضرارشبكية العين الظهرية. بمجرد تحديد المسافة المناسبة بين الأقطاب ، واستخدام المسمار التعديل على مقبض الأقطاب للحفاظ على ذلك عندما انتشر electroporating. هذا يحافظ على القطب السالب على مسافة المثلى من مقلة العين عند الضغط على أسفل القطب الموجب في الموقف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporate العين باستخدام الموجات ساحة CUY21 Electroporator (انظر المواد). يجب تعيين المعلمات electroporation لاثنين من البقول 50 مللي ثانية على التوالي ، في 75 وقفة مع V - 1 ثانية بين البقول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة الأسماك إلى الخزان. نبدأ عادة بروتوكول لدينا الضوء الناجم عن تنكس الشبكية ثابت فور electroporation. </li></ol> 5. ممثل النتائج : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمدة 3-5 أيام بعد electroporation (اعتمادا على استقرار morpholino) ، ويمكن تسمية lissamine يمكن تصور في جميع طبقات الشبكية في الشبكية مقطوع (الشكل 4). هذا بمثابة تأكيد لوجودوصفت morpholino. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكننا تحقيق كامل ضربة قاضية البروتين تصل إلى 3-5 أيام التالية electroporation ، تبعا للكفاءة morpholino (الشكل 5). عادة ، خلال دراسات علاج الضوء ، ونحن في موسم الحصاد العينين 3 أو 4 أيام بعد electroporation morpholino. يتم ذلك عن طريق إزالة العين بالكامل مع ملقط دومون 5B # مع نهايات منحنية الشكل (6 ؛ المواد) ، ومعالجة الأنسجة لالمناعية 15. كما هو الحال مع أي أسلوب ضربة قاضية ، يجب أن تظهر مظاهرة من ضربة قاضية كفاءة من أجل التحقق من النمط الظاهري. لذا ، نقترح الحصول على أمصال مضادة لبروتين اهتمامك. بدلا من ذلك ، وإذا كان الضد غير متوفر ويتم توجيه morpholino إما إلى متقبل لصق أو المانحة في موقع مرنا مسبقا ، فإنه سيتم منع الربط الفعال للمرنا. في هذه الحالة ، فمن الممكن استخدام عكس المنتسخة - PCR لتضخيم تسلسل الحمض النووي الريبي المرافقة في morphant وتحديد كفاءة عرقلة splic العاديجي النمط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما شبكية العين والأنف لمقطوع من الزمانية على المحور الظهري البطني ، مربعات مظللة الزرقاء (الشكل 6) تمثل مناطق الشبكية التي غالبا ما تلف من الحدث نفسه electroporation. المربع المظلل الوردي يمثل المنطقة التي تستهدف إدخال morpholino إلى خلايا الشبكية التي electroporation. </li></ol><img alt="الشكل 1." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig1.jpg" /> الشكل 1. تخطيطي يصور إزالة طبقات الطلائية للقرنية. اللوحة اليسرى ويبين الملامح الرئيسية الهيكلية للعين ، بما في ذلك العدسة (L) ، والزجاجي (فيت) ، وشبكية العين (R) ، والقرنية الخارجي (OC) ، والقرنية الداخلية (IC) ، وبروز القرنية ( CL). ويظهر اتجاه العين في الطبقة السفلى من حق الفريق الأول ، والمسمى الأمامي (A) ، الخلفي (P) ، الظهرية (D) ، والبطني (V). تلوين أحمر يدل على القرنية الخارجي التي يتم إزالتها. عموم second<html> شرم يوضح كيف يتم استخدام ملقط لفهم بروز القرنية واخراج القرنية الخارجي عبر العين في زاوية منخفضة (الفريق الثالث). لوحة الحق يبين كيف يمكن استخدام ملقط من الزوج الثاني للعين ثابت في حين سحب القرنية. <img alt="الشكل 2." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig2.jpg" /> الشكل 2. تخطيطي للخطوات المشاركة في الحقن intravitreal من morpholino. يتم إجراء شق صغير في العين حيث يلتقي التلميذ القزحية (اللوحة اليسرى). وينبغي أن الفجوة الناتجة تكون كبيرة بما يكفي لإبرة قياس 33 ، وهي مليئة morpholino الحل ، على أن تضاف (وسط لوحة). حقن ببطء 0.5 ميكروليتر من المحلول في الزجاجي (اللوحة اليمنى). يجب عليك تصور كمية صغيرة من محلول الزجاجية يخرج من شق كما يتم استبدال جزء من الجسم الزجاجي من قبل مع lissamine الموسومة morpholino (اللوحة اليمنى). ig3.jpg &quot;/&gt; الشكل 3. تخطيطي لإجراء electroporation العامة. يتم التفاف بلطف تخدير الأسماك ، والتي تم حقن intravitreally مع morpholino في منشفة ورقية رطبة (اللوحة اليسرى). يجب على منشفة ورقية تغطية الخياشيم ، ولكن ليس عرقلة العين (وسط لوحة). اضغط بلطف القطب الموجب لأسفل على بطني جزء من العين ، والسماح النصف الظهرية من العين لتدوير للخروج من مأخذ. وضع القطب السالب حوالي 1 ملم من النصف الظهرية من العين وبدء electroporation (اللوحة اليمنى). <img alt="الشكل 4." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig4.jpg" /> الشكل 4. متحد البؤر صورة مقارنة في شبكية العين عن طريق الحقن دون electroporated intravitreally a morpholino lissamine الموسومة (A) ، والشبكية a حقن intravitreally وelectroporated مع morpholino lissamine الموسومة (B). تم العثور على تسمية lissamine في جميع الطبقات الشبكية وأنواع الخلايا. ROS ، قضيب الخارجيشرائح ؛ y. قل ، طبقة النووي الخارجي ؛ ، طبقة داخلية INL النووية ؛ GCL ، طبقة الخلايا العقدية. <img alt="الشكل 5." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig5.jpg" /> الشكل 5. الصور متحد البؤر مقارنة PCNA immunolocalization في شبكية العين electroporated مع morpholino التحكم (لوحات اليسار) وشبكية العين مع electroporated morpholino مكافحة PCNA (لوحات اليمين) قبل الضوء الناجم عن موت الخلايا المستقبلة للضوء. وضعت مظلمة مكيفة الزرد البيضاء الكبار في ضوء مكثفة مستمرة لمدة 1 أو 2 أو 3 أيام بعد electroporation من morpholino. فشلت في السيطرة morpholino لقمع التعبير PCNA زيادة في شبكية العين بأضرار خفيفة. وmorpholino مكافحة PCNA طرقت بكفاءة أسفل PCNA بروتين تعبير من خلال ثلاثة أيام من وقوع اضرار طفيفة ثابت مكثفة. <img alt="الشكل 6." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig6.jpg" /> الشكل 6. التخطيطي (اللوحة اليسرى) تظهر قلع العين لعوrocessing cryosectioning ، والتي تتم على طول محور بطني الظهرية. المربع الوردي مظللة (اللوحة اليمنى) يظهر في المنطقة الشبكية مع أكبر قدر من ضربة قاضية البروتين باستخدام هذه التقنية. المربعات الزرقاء المظللة تمثل المناطق التي غالبا ما تكون تضررت من جراء الحدث electroporation. يسمى اتجاه العين الأمامي (A) ، الخلفي (P) ، الظهرية (D) ، والبطني (V).

<ol>
	<li>Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proneural+basic+helix-loop-helix+gene+ascl1a+is+required+for+retina+regeneration.">The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration.</a> J. Neurosci. 28, 1109-1117 (2008).</li><li>Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+inner+retinal+neurons+after+intravitreal+injection+of+ouabain+in+zebrafish.">Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish.</a> J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).</li><li>Hitchcock, P., Ochocinska, M., Sieh, A., Otteson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+injury-induced+neurogenesis+in+the+vertebrate+retina.">Persistent and injury-induced neurogenesis in the vertebrate retina.</a> Prog. Retin. Eye Res. 23, 183-194 (2004).</li><li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish.">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> B.M.C Dev. Biol. 6, 36-36 (2006).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).</li><li>Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-+and+dose-dependent+influence+of+ouabain+on+the+ultrastructure+of+optic+neurones.">Time- and dose-dependent influence of ouabain on the ultrastructure of optic neurones.</a> Cell Tissue Res. 164, 503-517 (1975).</li><li>Wu, D. M., Schneiderman, T., Burgett, J., Gokhale, P., Barthel, L., Raymond, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cones+regenerate+from+retinal+stem+cells+sequestered+in+the+inner+nuclear+layer+of+adult+goldfish+retina.">Cones regenerate from retinal stem cells sequestered in the inner nuclear layer of adult goldfish retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42, 2115-2124 (2001).</li><li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Muller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish.">Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li><li>Vihtelic, T. S., Soverly, J. E., Kassen, S. C., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+regional+differences+in+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+light-lesioned+albino+zebrafish.">Retinal regional differences in photoreceptor cell death and regeneration in light-lesioned albino zebrafish.</a> Exp. Eye Res. 82, 558-575 (2006).</li><li>Kassen, S. C., Ramanan, V., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Liu, C. G., Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+analysis+of+gene+expression+during+light-induced+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+albino+zebrafish.">Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).</li><li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo:+a+novel+antisense+approach.">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Dev. Biol. 222, 124-134 (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morpholino+phenocopy+of+the+mouse+mos+mutation.">A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation.</a> Genesis. 30, 198-200 (2001).</li><li>London, C. A., Sekhon, H. S., Arora, V., Stein, D. A., Iversen, P. L., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+antisense+inhibitor+of+MMP-9+attenuates+angiogenesis,+human+prostate+cancer+cell+invasion+and+tumorigenicity.">A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity.</a> Cancer Gene Ther. 10, 823-832 (2003).</li><li>Thummel, R., Kassen, S. C., Enright, J. M., Nelson, C. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Muller+glia+and+neuronal+progenitors+during+adult+zebrafish+retinal+regeneration.">Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration.</a> Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).</li><li>Cameron, D. A., Gentile, K. L., Middleton, F. A., Yurco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+intact+and+regenerating+zebrafish+retina.">Gene expression profiles of intact and regenerating zebrafish retina.</a> Mol. Vis. 11, 775-791 (2005).</li><li>Craig, S. E., Thummel, R., Ahmed, H., Vasta, G. R., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+galectin+Drgal1-l2+is+expressed+by+proliferating+Muller+glia+and+photoreceptor+progenitors+and+regulates+the+regeneration+of+rod+photoreceptors.">The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 3244-3252 (2010).</li><li>Thummel, R., Enright, J. M., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Bailey, T. J., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6a+and+Pax6b+are+required+at+different+points+in+neuronal+progenitor+cell+proliferation+during+zebrafish+photoreceptor+regeneration.">Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration.</a> Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).</li><li>Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+glial+cell+division+blocks+regeneration+of+the+light-damaged+zebrafish+retina.">Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina.</a> Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).</li><li>Thummel, R., Bai, S., Sarras, M. P., Song, P., McDermott, J., Brewer, J., Perry, M., Zhang, X., Hyde, D. R., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fin+regeneration+using+in+vivo+electroporation+of+morpholinos+against+fgfr1+and+msxb.">Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb.</a> Dev. Dyn. 235, 336-346 (2006).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+excitability,+and+transfection+of+retinal+neurons+in+an+organotypic+culture+of+mature+zebrafish+retina.">Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina.</a> Cell Tissue Res. 332, 195-209 (2008).</li></ol>

ليس لدينا ما تكشف

مؤخرا ، بحثت تحليلين ميكروأري التغييرات التعبير الجيني التي حدثت خلال تجديد إما شبكية العين للضوء تلف أو تصحيحا جراحيا ، يستأصل الشبكية 10 و 16. وكشفت دراسات كلا الجينات العديدة التي عرضت تغييرات كبيرة في التعبير ، وإما زيادة أو النقصان ، يرجح أن تكون مطلوبة من أجل الأحداث المختلفة التي تحدث أثناء تجديد شبكية العين ، مثل رجوعها من الدبقية مولر في دورة الخلية ، واصلت الانتشار وهجرة أسلاف الخلايا العصبية في طبقة الشبكية التالفة ، والتفريق بين الأسلاف العصبية إلى نوع من الخلايا العصبية الصحيحة. في حين أن المقارنة المباشرة لهاتين المجموعتين البيانات ميكروأري تكشف الجينات المرشحة التي قد تكون ضالعة في هذه الأحداث الخلوية ، في نهاية المطاف يجب أن يكون اختبار هذه الجينات والبروتينات التي ترميز لتحديد ما إذا كانت ضرورية لتجديد الخلايا العصبية. هنا ، نحن تصف خسارة قوية من وظيفة إلى نهج conditioالبروتينات ضربة قاضية نالي الفائدة في شبكية العين الزرد الكبار. وقد استخدمت هذه التقنية لدراسة كل من البروتينات داخل الخلايا وخارج الخلية ، وكذلك جزيئات الإشارة ، عوامل النسخ والبروتينات اللازمة لتكرار الحمض النووي 17-19. وهكذا ، ساعد هذا الأسلوب إلى حد كبير فهمنا للآلية الجزيئية الكامنة وراء الشبكية التجدد الكبار في الزرد. نحن اختبار المعلمات electroporation متعددة (الجهد ، وعدد من البقول ، والوقت بين البقول) قبل التوصل إلى بروتوكول ناجحة. يستخدم التقرير السابق للelectroporating morpholinos في الزعنفة الذيلية الزرد تجديد 10 نبضات في الجهد المنخفض (15 V) 20. لأن حاصرت الشبكية الزرد الكبار بحلول طبقات خلايا متعددة وغير قابل للوصول بسهولة إلى أقطاب منتاش ، كانت المعايير المستخدمة في زعنفة ناجحة في electroporating بكفاءة morpholinos الكبار في شبكية العين. في المقابل ، فان الجهد العالي (100 V) الدقة في كثير من الأحيانulted في الموت للأسماك. مؤخرا ، 5 البقول من 80 وصفت الخامس لelectroporate DNA البلازميد في شبكية العين الماوس الجرو الوليد 21. وجدنا أن أقل قليلا مكثفة 2 البقول من 75 V أسفرت electroporation الناجح لmorpholinos في شبكية العين الزرد الكبار مع بقاء 100 ٪ من الأسماك المعالجة. بالإضافة إلى ذلك ، اكتشفنا أن إزالة معظم الخارجي (أو الخارجي الأكثر) المكون من القرنية إلى زيادة كبيرة في كفاءة electroporation. وقد تزايد عدد نبضات قضاء على الحاجة لإزالة هذا النسيج لكنها قد تتسبب أيضا في زيادة تلف الأنسجة. دراسات مراقبة واسعة النطاق أثبتت أن هذه المعايير لم يسبب أي موت الخلايا الشبكية كبيرة أو تغيير استجابات محددة الخلوية التي لوحظت خلال 19 التجدد مبصرة. مكسب من بين الدراسات وظيفة لا يمكن حاليا استخدام هذه التقنية في الجسم الحي ، وذلك بسبب عدم قدرتنا على الدوام electroporate الأحماض النووي الريبي كبيرة في جميع صetinal الخلايا. ومع ذلك ، فإن نجاح electroporating البلازميدات في شبكية العين الماوس في الجسم الحي والزرد في شبكية العين explants يوحي بأنه لا يزال هناك احتمال في الزرد 21 و 22. واحدة من نقاط القوة في هذه التقنية هو electroporation يبدو أن أعرض morpholino بكفاءة في جميع أنواع الخلايا الشبكية المختلفة. ومع ذلك ، كان واحدا الضعف المحتملة التي electroporation تسليمها بكفاءة morpholino في المناطق الوحيدة التي الشبكية الظهرية والمركزية. حدث electroporation الثانية في اتجاه النصف البطنية من شبكية العين في استهداف النتائج الجيدة لجميع الطبقات ، ولكن غالبا ما يؤدي إلى الضرر. هذا التقييد المكاني ربما كان ذلك بسبب الشكل والموضع من الأقطاب الكهربائية. قد استخدام أقطاب كوب مصمم خصيصا على شكل يمكن أن توضع حول العين في تحسين هذا الضعف. هذا التقييد المكاني للتسليم morpholino يحد من استخدام هذه التقنية ، ويحول دون استخدام للمقايسة يمثح وتحليل ERG التي تتطلب إجراء تقييم عالمي للشبكية. وتجدر الإشارة إلى أنه كما هو الحال مع أي تجربة morpholino ، فإنه من المستحسن لتأكيد النتائج الخاص به ثانية ، وعدم التداخل morpholino مرنا إلى الهدف. في بعض الحالات ، فمن الممكن أيضا اثنين من electroporate morpholinos مختلفة في نفس الوقت ضربة قاضية إلى التعبير عن اثنين من البروتينات المختلفة. أثبتنا ذلك من خلال اسقاط التعبير عن Pax6a على حد سواء والبروتينات Pax6b ، منفردة ومجتمعة 18. على الرغم من أننا أظهر استخدام هذه التقنية مع نموذجنا الأضرار الخفيفة يمكن ، من المحتمل أن تستخدم لدراسة تجديد في النماذج أو غيرها من الأضرار 2-8 تستخدم لفحص وظيفة من البروتينات الموجودة في الشبكية التالفة. على سبيل المثال ، يمكن أن تستخدم من electroporation morpholinos ضربة قاضية إلى التعبير عن قنوات محددة أو الجزيئات نقل الإشارة في العقدة أو خلايا عديم الاستطالات ودراسة ثم وظيفة هذه الإشاراتمسارات في معالجة بصرية. لكن ، وكما morpholinos تؤثر فقط على الترجمة من البروتين الجديد ، فإن المرء لابد أن ينتظر حتى الذاتية دوران البروتين يحدث قبل أن يتم تنفيذ الفحص. اعتمادا على الاستقرار من البروتين ، يمكن أن تتراوح من ساعة إلى 18 يوما.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> CUY21 - EDIT أو CUY21 - SC ساحة موجة electroporator </td><td> بروتك الدولية </td><td> CUY21EDIT أو CUY21SC </td><td> كلا وحدات العمل لهذا البروتوكول </td></tr><tr><td> 3 ملم أقطاب قطرها مجداف </td><td> بروتك الدولية </td><td> CUY 650 - P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morpholino </td><td> GeneTools ، ذ م م </td><td></td><td> وينبغي Morpholino مصممة خصيصا لبروتين اهتمامك </td></tr><tr><td> 2 - Phenoxyethanol </td><td> سيغما </td><td> 77861 - 1L </td><td> التخدير ؛ تمييع 1:1000 في الماء الأسماك للنظام الداخلي ، 1:500 للقتل الرحيم </td></tr><tr><td> دومون # 5 ملاقط </td><td> العالم آلات دقيقة </td><td>14095 </td><td> أي ملاقط # 5 مع العمل </td></tr><tr><td> ملاقط دومون 5B # مع نصائح الزاوية </td><td> العالم آلات دقيقة </td><td> 500234 </td><td> تستخدم في العين استأصل القتل الرحيم التالية </td></tr><tr><td> الياقوت شفرة ، وضعف حافة انس ، 1 ملم واسعة ، مع مقبض السكين الياقوت </td><td> العالم آلات دقيقة </td><td> شفرة : 500314 مقبض : 500317 </td><td></td></tr><tr><td> هاميلتون المحاقن مع إزالة 33 قياس حادة في نهاية الإبرة </td><td> هاميلتون الشركة </td><td> حقنة : 87930 إبرة : 7762-06 </td><td> إزالة الإبرة التي تأتي مع حقنة واستبدالها ب 33 عيار حادة في نهاية الإبرة </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina

العديد من الأمراض المدمرة الموروثة العين ينتج العمى التدريجي الذي لا رجعة فيه لأن البشر لا يمكن تجديد الخلايا العصبية المريضة أو الموت في شبكية العين. في المقابل ، فإن الشبكية الزرد أخلاقي قوي يمتلك القدرة على التجدد تلقائيا أي فئة العصبية التي فقدت في مجموعة متنوعة من نماذج مختلفة لتلف شبكية العين ، بما في ذلك ثقب في شبكية العين ، التذرية الكيميائية ، وارتفاع في درجة الحرارة المركزة ، والعلاج المكثف ضوء 1-8. مختبرنا تميزت على نطاق واسع من التجديد المستمر مبصرات التالية العلاج المكثف ضوء في شبكية العين والخلايا العصبية الداخلية بعد intravitreal ouabain حقن 2 ، 5 ، 9. في جميع الحالات ، المقيم الدبقية مولر إعادة إدخال دورة الخلية لانتاج الخلايا العصبية الأسلاف ، التي ما زالت تتكاثر وتهاجر إلى طبقة الشبكية سليمة ، حيث تفرق في الخلايا العصبية ناقصة. تتميز نحن خمس مراحل مختلفة خلال تجديد داما الخفيفGED الشبكية التي أبرزها استجابات الخلايا المحددة. حددنا عدة جينات وأعرب تفاضلي في كل مرحلة من التجدد في شبكية العين عن طريق التحليل ميكروأري مرنا 10. كثير من هذه الجينات هي أيضا حاسمة بالنسبة للتنمية العين. لاختبار دور كل الجينات مرشح / البروتين خلال تجديد شبكية العين ، نحن في حاجة إلى تطوير طريقة للحد من التعبير مشروط من البروتين المرشح الوحيد في بعض الأحيان خلال التجديد للشبكية الكبار. وتستخدم على نطاق واسع لدراسة oligos Morpholino فقدان وظائف بروتينات معينة أثناء وضع الزرد ، القيطم والحمص ، والماوس ، والاورام في 11-14 xenografts الإنسان. هذه basepair oligos تعديل تسلسل الحمض النووي الريبي مع مكملة لكتلة إما الربط أو الترجمة من الحمض النووي الريبي الهدف. Morpholinos مستقرة في الخلية ، ويمكن القضاء عليها أو التعبير &quot;ضربة قاضية&quot; البروتين لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام 12. هنا ،وصفنا أسلوبا لاستهداف التعبير بكفاءة ضربة قاضية البروتين في شبكية العين الزرد الكبار. هذا الأسلوب يستخدم lissamine الموسومة morpholinos العقاقير التي يتم حقنها في الجسم الزجاجي للعين الزرد الكبار. باستخدام الملقط الكهربائي ، ثم هو electroporated morpholino في جميع أنواع الخلايا في شبكية العين الظهرية والمركزية. Lissamine يوفر هذا الاتهام على لmorpholino electroporation ويمكن تصور لتقييم وجود morpholino في خلايا الشبكية. يمكن أن تستخدم ضربة قاضية الشرطية في شبكية العين لدراسة دور بروتينات معينة في أوقات مختلفة خلال التجدد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذا النهج لدراسة دور بروتينات معينة في الشبكية سليمة ، في عمليات مثل تنبيغ البصرية وتجهيز الخلايا العصبية البصرية في الدرجة الثانية.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina at JoVE.com

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

تم وصف طريقة لضربة قاضية مشروط التعبير بروتين هدف في شبكية العين الزرد الكبار ، والذي ينطوي على حقن العقاقير وintravitreally morpholinos electroporating لهم في شبكية العين. طرقت هو البروتين الناتج باستمرار لعدة أيام ، والذي يسمح اختبار دور البروتين في تجديد أو شبكية العين سليمة.

في الجسم الحي من Electroporation Morpholinos في شبكية العين اسماك الزرد الكبار

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

زرع نخاع الكلى في الجامعة اسماك الزرد الكبار

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

عضوي النمط من الثقافة الشبكية أرنب الكبار

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

وحيد الخلية في الجسم الحي Electroporation داخل الدماغ سليمة النامية

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

الرجعية المدارية في حقن اسماك الزرد الكبار

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

تشريح هيئات من اسماك الزرد الكبار

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

حقن داخل الصفاق الى اسماك الزرد الكبار

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

التسليم المباشر للMorpholinos MIF في Otocyst اسماك الزرد عن طريق الحقن وElectroporation يؤثر على التنمية الداخلية الأذن

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

زرع الخلايا مباشرة في الكلى من اسماك الزرد الكبار

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

تشريح الكلى اسماك الزرد الكبار

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

في Electroporation المجراة من Morpholinos في الكبار التجديد زعنفة الذيل الزرد

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...