Name: in vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina
Uploaded: 2011-12-27T12:00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Freimann Life Science Center og Center for zebrafisk Forskning personale for deres pleje og vedligeholdelse af zebrafisk.

1. Morpholino forberedelse: <ol><li> Alle morpholino oligos bør være specialdesignet og bestilles gennem GeneTools (Philomath, OR). Vi bruger de positivt ladede Lissamin-mærket morpholinos at drive electroporated morpholinos mod den negative elektrode. Vi prøvede uden held at målrette negativt ladede fluorescein-mærket morpholinos til den positive elektrode med denne teknik. Fortynd 300 nmol af morpholino i 100 μl af nuklease-frit vand til at give en 3 mM løsning. Alikvot de morpholino i flere paraffin-forseglede mikrocentrifugerør. Opbevares væk fra lys ved stuetemperatur. </li><li> Bestem morpholino koncentrationen ved at fortynde 5 mikroliter af morpholino (eller vand, der bruges til at fortynde morpholino som en tom) i 95 μl af 0,1 N HCl. Indstil spektrofotometeret bølgelængde (λ) til 265 nm. Beregn den konstante for din morpholino hjælp af følgende ligning: Konstant = molekylvægt navnlig til din morpholino X 1000/molar absorbans. </li><li> Du vil finde den molekylære vægt og molære absorbans data på &quot;Oligo Egenskaber&quot; ark med hver morpholino. Analyser den tomme for at kontrollere baseline målinger og tage målinger af hver fortyndet morpholino. Multiplicere absorbansen ved 265 nm af hver morpholino ved sin bestemmes konstant og med fortyndingsfaktoren for at få koncentrationen i ng / mikroliter. Divider dette tal med molekylvægt til at bestemme koncentrationen i mM. Fortynd morpholino, hvis det er nødvendigt, at en arbejdsgruppe koncentration. </li></ol> 2. Fjern den ydre hornhinde-lag: <ol><li> Bedøver 6-12 måneder gamle voksne zebrafisk i Tricaine eller 2-phenoxyethanol på 1,0 mg / ml i zebrafisk tank vand. </li><li> Wrap zebrafisk i et fugtet stykke køkkenrulle, som dækker gællerne, men forlader øjet udsættes for. Den indpakkede fisk er placeret under en Stereoskopet og forstørrelse øges, indtil diameteren i øjet fylder cirka en tredjedel afdet visuelle felt (Figur 1). </li><li> Brug Dumont # 5 pincet, tag fat i yderste hornhinden nær den optiske revne. Dette væv er farvet røde, og er mærket &quot;OC&quot; i figur 1. Der er en lille fremspring eller læbe angivet med pilen mærket &quot;CL&quot;. Træk i en lav vinkel (dvs. 10 grader) over øjet til at fjerne den ydre hornhinde. Med praksis, kan dette være afsluttet i én bevægelse. Hvis pincetten slip, re-grab i vævet og igen trække i en lav vinkel, indtil fjernet. Et godt fastgjort hornhinden kan forårsage øjet at forrykke sig ud af stikkontakten, når de trækkes. Du kan holde øjet i at blive fortrængt af støttehjul med et andet sæt af pincet. </li></ol> 3. Cornea snit og morpholino injektion: <ol><li> Umiddelbart efter fjernelsen af ​​den ydre hornhinden, lave et lille snit i hornhinden, hvor eleven opfylder iris (figur 2). Dette gøres ved hjælp af en safir klinge skalpel (Se Materialer). </li><li> Load 0,5 μl af 3,0 mm morpholino løsning i en Hamiltpå sprøjte med en 33 gauge aftagelig, stump-end kanylen (se Materialer). Pipette op og ned for at fjerne luftbobler i rækken. Sæt forsigtigt nålen ind i glasagtige gennem snit (Figur 2). Sæt ikke nålen for langt, eller du vil punktere nethinden eller fortrænge linsen. </li><li> Injicer langsomt den morpholino opløsningen i vitreal rummet. Afhængig af alder af de fisk, vil vitreal plads hold ~ 0,5 μl. Du skal visualisere uncolored glaslegeme siver ud af snittet, da det er fordrevet af morpholino løsning. Indsprøjtes, indtil en lille mængde morpholino løsning siver ud af snittet. Du bør klart visualisere Lissamin-mærket morpholino inde i øjet. </li><li> Efter injektionen, fiskene vender tilbage til tanken for at komme sig. Vi plejer kun injicere venstre øje, ved hjælp af højre øje som en uninjected kontrol, men elektroporation på begge øjne er mulig. </li></ol> 4. Elektroporation: <ol><li> Efterindsprøjtning af ca 10 fisk, re-bedøver en injiceret fisk og pak det ind i et fugtigt stykke køkkenrulle, blot dækker gællerne, men forlader øjet udsættes for. Overfør fisk til en petriskål. Tag latex eller lignende handsker for at undgå eksponering for anæstesi. Mens forsigtigt holder fiskene i bunden af ​​fadet, fyld fadet med anæstesi (Figur 3, venstre panel). </li><li> En 3-mm-diameter platin plade elektrode (Se Materialer) lokaliserer de elektroporation impulser til cirka halvdelen af ​​nethinden. Vi typisk målrette den dorsale nethinden. Tryk forsigtigt positive elektrode nedad på den ventrale halvdel af øjet. Med det yderste hornhinden fjernet, er øjet let roteres, udsætte dorsale del af øjeæblet. </li><li> Mens stadig trykke ned på den ventrale side af øjet, skal du placere den negative elektrode tæt (~ 1 - 2 mm) den udsatte dorsale halvdel af øjet. Vær forsigtig med ikke at røre ved den negative elektrode direkte til øjet, hvilket vil resultere i skadeligeden dorsale nethinden. Når du bestemme den passende afstand mellem elektroderne, skal du bruge justeringsskrue på håndtaget af elektroderne at fastholde, at spredes, når electroporating. Dette holder den negative elektrode en optimal afstand fra øjeæblet, når den positive elektrode er trykket ned i position. </li><li> Electroporate øjet ved hjælp af en CUY21 Square Wave Electroporator (Se Materialer). Den elektroporation parametre skal indstilles til to på hinanden følgende 50-msek impulser, ved 75 V, med en 1-sek pause mellem pulser. </li><li> Retur fisk til tanken. Vi starter typisk vores protokol for konstant lys-induceret retinal degeneration umiddelbart efter elektroporation. </li></ol> 5. Repræsentative resultater: <ol><li> I 3-5 dage efter elektroporation (afhængig af stabilitet morpholino), kan Lissamin etiketten skal visualiseres i alle de retinale lag i et sektioneret nethinden (Figur 4). Dette tjener som en bekræftelse for tilstedeværelse afde mærkede morpholino. </li><li> Vi kan opnå fuld protein Knockdown op til 3-5 dage efter elektroporation, afhængig af effektiviteten af ​​de morpholino (Figur 5). Typisk, under lysbehandling undersøgelser, høst vi øjne på 3 eller 4 dage efter morpholino elektroporation. Dette gøres ved at fjerne hele øjet med Dumont # 5B pincet med buede ender (figur 6, Materialer) og behandling af væv til immunhistokemi 15. Som med enhver Knockdown teknik, skal en demonstration af effektive Knockdown blive vist med henblik på at validere fænotype. Derfor foreslår vi at få antisera til din protein af interesse. Alternativt, hvis og antistof er ikke til rådighed, og morpholino er rettet til enten splejse acceptor eller donorstedet i den præ-mRNA, vil det blokere effektiv splejsning af mRNA. I dette tilfælde er det muligt at anvende reverse transkriptase-PCR til at forstærke de flankerende sekvenser i morphant RNA og bestemme effektiviteten af ​​at blokere den normale splicING mønster. </li><li> Når nethinder er sektioneret fra nasal til tidsmæssige på ryg ventrale akse, det skraverede blå kasser (Figur 6) repræsenterer de områder af nethinden, der oftest beskadigede fra elektroporation selve arrangementet. Det skraverede lyserøde felt repræsenterer det område, der er målrettet til morpholino indførelse i retinal celler af elektroporation. </li></ol><img alt="Figur 1." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig1.jpg" /> Figur 1. Skematisk skildrer fjernelse af epitel lag af hornhinden. Det venstre panel viser de vigtigste strukturelle træk i øjet, herunder linsen (L), den glasagtige (Vit), nethinden (R), den ydre hornhinde (OC), den inderste hornhinden (IC), og hornhindens protrusion ( CL). Orienteringen af ​​øjet er vist i nederste højre hjørne af første panel, og er mærket anterior (A), posterior (P), bryst (D), og ventral (V). Den røde farve angiver den ydre hornhinden, der er fjernet. Den anden pan<html> el viser, hvordan tang er brugt til at forstå hornhindens fremspring og at trække den ydre hornhinde over øjet i en lav vinkel (tredje panel). Højre panel viser, hvordan et andet par af tang kan bruges til stabil øjet, mens du trækker hornhinden. <img alt="Figur 2." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig2.jpg" /> Figur 2. Skematisk af de trin, der er involveret i den intravitreale injektion af morpholino. Et lille snit er lavet i øjet, hvor eleven opfylder iris (venstre panel). Den resulterende hul skal være lige stor nok til en 33 gauge kanyle, der er fyldt med morpholino løsning, der skal indsættes (midterste panel). Injicer langsomt 0,5 μl af opløsningen i den glasagtige (højre panel). Du skal visualisere en lille mængde vitreal løsning kommer ud af indsnit de glasagtige delvist erstattes af med Lissamin-mærkede morpholino (højre panel). ig3.jpg &quot;/&gt; Figur 3. Skematisk af den generelle elektroporation procedure. De bedøvede fisk, som blev intravitrealt injiceres med de morpholino, er forsigtigt pakket ind i fugtigt køkkenrulle (venstre panel). Den køkkenrulle bør dække gællerne, men ikke til hinder for øjet (midterste panel). Tryk forsigtigt positive elektrode ned på den ventrale del af øjet, så dorsale halvdel af øjet til at rotere ud af stikkontakten. Placer den negative elektrode ca 1 mm fra den dorsale halvdel af øjet, og start elektroporation (højre panel). <img alt="Figur 4." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig4.jpg" /> Figur 4. Konfokal billede sammenligne en nethinden electroporated uden intravitrealt indsprøjte et Lissamin-mærket morpholino (A), og en nethinden intravitrealt injiceres og electroporated med Lissamin-mærkede morpholino (B). Den Lissamin mærket findes i alle de retinale lag og celletyper. ROS, Rod ydresegmenter; Onlinekanaler, ydre nukleare lag; INL, inderste nukleare lag; GCL, ganglion cellelag. <img alt="Figur 5." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig5.jpg" /> Figur 5. Konfokal billeder sammenligne PCNA immunolocalization i nethinder electroporated med en kontrolgruppe morpholino (venstre paneler) og nethinder electroporated med en anti-PCNA morpholino (højre paneler) forud for lys-induceret fotoreceptor celledød. Dark-tilpasset voksen albino zebrafisk blev placeret i konstant intense lys for 1, 2 eller 3 dage efter elektroporation af morpholino. Kontrollen morpholino undladt at undertrykke stigende PCNA udtryk i lys-beskadigede nethinder. Den anti-PCNA morpholino effektivt slået ned PCNA protein udtryk gennem tre dage med konstant intense lys skader. <img alt="Figur 6." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig6.jpg" /> Figur 6. Skematisk (venstre panel), der viser enucleation i øjet for pEHANDLING og cryosectioning, hvilket sker langs ryggens ventrale akse. Den lyserøde skraverede felt (højre panel) viser retinal region med den største mængde af protein Knockdown med denne teknik. Den blå skraverede kasser repræsenterer områder, der oftest beskadiget af elektroporation begivenhed. Orienteringen af ​​øjet er mærket anterior (A), posterior (P), bryst (D), og ventral (V).

<ol>
	<li>Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proneural+basic+helix-loop-helix+gene+ascl1a+is+required+for+retina+regeneration.">The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration.</a> J. Neurosci. 28, 1109-1117 (2008).</li><li>Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+inner+retinal+neurons+after+intravitreal+injection+of+ouabain+in+zebrafish.">Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish.</a> J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).</li><li>Hitchcock, P., Ochocinska, M., Sieh, A., Otteson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+injury-induced+neurogenesis+in+the+vertebrate+retina.">Persistent and injury-induced neurogenesis in the vertebrate retina.</a> Prog. Retin. Eye Res. 23, 183-194 (2004).</li><li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish.">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> B.M.C Dev. Biol. 6, 36-36 (2006).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).</li><li>Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-+and+dose-dependent+influence+of+ouabain+on+the+ultrastructure+of+optic+neurones.">Time- and dose-dependent influence of ouabain on the ultrastructure of optic neurones.</a> Cell Tissue Res. 164, 503-517 (1975).</li><li>Wu, D. M., Schneiderman, T., Burgett, J., Gokhale, P., Barthel, L., Raymond, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cones+regenerate+from+retinal+stem+cells+sequestered+in+the+inner+nuclear+layer+of+adult+goldfish+retina.">Cones regenerate from retinal stem cells sequestered in the inner nuclear layer of adult goldfish retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42, 2115-2124 (2001).</li><li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Muller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish.">Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li><li>Vihtelic, T. S., Soverly, J. E., Kassen, S. C., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+regional+differences+in+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+light-lesioned+albino+zebrafish.">Retinal regional differences in photoreceptor cell death and regeneration in light-lesioned albino zebrafish.</a> Exp. Eye Res. 82, 558-575 (2006).</li><li>Kassen, S. C., Ramanan, V., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Liu, C. G., Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+analysis+of+gene+expression+during+light-induced+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+albino+zebrafish.">Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).</li><li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo:+a+novel+antisense+approach.">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Dev. Biol. 222, 124-134 (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morpholino+phenocopy+of+the+mouse+mos+mutation.">A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation.</a> Genesis. 30, 198-200 (2001).</li><li>London, C. A., Sekhon, H. S., Arora, V., Stein, D. A., Iversen, P. L., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+antisense+inhibitor+of+MMP-9+attenuates+angiogenesis,+human+prostate+cancer+cell+invasion+and+tumorigenicity.">A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity.</a> Cancer Gene Ther. 10, 823-832 (2003).</li><li>Thummel, R., Kassen, S. C., Enright, J. M., Nelson, C. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Muller+glia+and+neuronal+progenitors+during+adult+zebrafish+retinal+regeneration.">Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration.</a> Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).</li><li>Cameron, D. A., Gentile, K. L., Middleton, F. A., Yurco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+intact+and+regenerating+zebrafish+retina.">Gene expression profiles of intact and regenerating zebrafish retina.</a> Mol. Vis. 11, 775-791 (2005).</li><li>Craig, S. E., Thummel, R., Ahmed, H., Vasta, G. R., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+galectin+Drgal1-l2+is+expressed+by+proliferating+Muller+glia+and+photoreceptor+progenitors+and+regulates+the+regeneration+of+rod+photoreceptors.">The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 3244-3252 (2010).</li><li>Thummel, R., Enright, J. M., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Bailey, T. J., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6a+and+Pax6b+are+required+at+different+points+in+neuronal+progenitor+cell+proliferation+during+zebrafish+photoreceptor+regeneration.">Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration.</a> Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).</li><li>Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+glial+cell+division+blocks+regeneration+of+the+light-damaged+zebrafish+retina.">Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina.</a> Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).</li><li>Thummel, R., Bai, S., Sarras, M. P., Song, P., McDermott, J., Brewer, J., Perry, M., Zhang, X., Hyde, D. R., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fin+regeneration+using+in+vivo+electroporation+of+morpholinos+against+fgfr1+and+msxb.">Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb.</a> Dev. Dyn. 235, 336-346 (2006).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+excitability,+and+transfection+of+retinal+neurons+in+an+organotypic+culture+of+mature+zebrafish+retina.">Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina.</a> Cell Tissue Res. 332, 195-209 (2008).</li></ol>

Vi har intet at videregive

For nylig, to microarray analyser undersøgt genekspression ændringer, der skete i løbet af regenerering af enten lys-beskadigede nethinden eller en kirurgisk fjernet retinal patch 10, 16. Begge undersøgelser viste en lang række gener, der udstilles væsentlige ændringer i sit udtryk, enten stigende eller faldende, som sandsynligvis er nødvendige for forskellige hændelser, der forekommer under retinale regenerering, såsom genindførsel af Müller glia ind i cellecyklus, fortsatte spredning og migration af neuronale forfædre til de beskadigede retinal lag, og differentieringen af ​​det neurale stamceller ind i den korrekte neuronale celle type. Mens en direkte sammenligning af disse to microarray datasæt afslører kandidatgener, der kan inddrages i disse cellulære begivenheder i sidste ende disse gener og deres kodede proteiner skal testes for at afgøre, om de er nødvendige for neuronale regenerering. Her beskriver vi en kraftig tab af funktion tilgang til conditiointernt Knockdown proteiner af interesse i den voksne zebrafisk nethinden. Denne teknik har været anvendt til at studere både ekstracellulære og intracellulære proteiner samt signalmolekyler, transkriptionsfaktorer og proteiner nødvendig for DNA-replikation 17-19. Således har denne metode i høj grad hjulpet vores forståelse af den molekylære mekanisme bag voksne retinale regenerering i zebrafisk. Vi har testet flere elektroporation parametre (spænding, antallet af impulser, tid mellem pulser), før en succesfuld protokol blev opnået. En tidligere rapport fra electroporating morpholinos i regenererende zebrafisk halefinnen brugt 10 impulser ved lav spænding (15 V) 20. Fordi den voksne zebrafisk nethinden er omgivet af flere cellelag og er ikke let tilgængelig for pincet elektroder, de parametre, der anvendes i fin lykkedes ikke at sikre effektiv electroporating morpholinos i den voksne nethinden. Omvendt er en høj spænding (100 V) ofte resulted i døden til fiskene. For nylig, 5 pulser på 80 V blev beskrevet at electroporate plasmid DNA i den nyfødte mus hvalpen nethinden 21. Vi fandt, at en lidt mindre intens 2 pulser på 75 V resulterede i vellykket elektroporation af morpholinos ind i den voksne zebrafisk nethinden med overlevelse på 100% af de behandlede fisk. Derudover opdagede vi, at fjernelsen af ​​den ydre mest (eller ekstern fleste) del af hornhinden i høj grad øget elektroporation effektivitet. At øge antallet af impulser kan fjerne behovet for fjernelse af dette væv, men kan også forårsage større vævsskader. Omfattende kontrol undersøgelser vist, at disse parametre ikke medfører væsentlige retinal celledød eller ændre den specifikke cellulære respons observeret i løbet af fotoreceptor regenerering 19. Gain-of-funktion undersøgelser er i øjeblikket ikke muligt at bruge denne teknik in vivo, på grund af vores manglende evne til konsekvent at electroporate store rebonukleinsyre syrer i alle retinal celler. Men den succes electroporating plasmider i mus nethinden in vivo og zebrafisk nethinden i eksplanteret antyder er det stadig en mulighed i zebrafisk 21, 22. En af styrkerne ved denne teknik er elektroporation tilsyneladende effektivt indføre morpholino i alle de forskellige retinal celletyper. Men en potentiel svaghed var, at elektroporation effektivt leveret morpholino ind kun ryg og centrale retinal regioner. En anden elektroporation begivenhed mod ventrale halvdel af nethinden resultater i god målretning til alle lag, men ofte resulterer i skader. Denne rumlige begrænsning sandsynligvis skyldtes den form og placering af elektroder. Brugen af ​​specialdesignede kop formede elektroder, der kunne placeres omkring øjet kan forbedre denne svaghed. Denne rumlige begrænsning af morpholino levering begrænser brugen af ​​denne teknik, og udelukker anvendelsen af ​​en analyse sucH som ERG analyse, der vil kræve en samlet vurdering af nethinden. Det skal bemærkes, at som med alle morpholino eksperiment, er det tilrådeligt at bekræfte dine resultater ved hjælp af en anden, ikke-overlappende morpholino til målet mRNA. I nogle tilfælde er det også muligt at electroporate to forskellige morpholinos samtidigt for at Knockdown udtryk for to forskellige proteiner. Vi har demonstreret dette ved at banke ned udtryk for både Pax6a og Pax6b proteiner, enkeltvis og i kombination 18. Selvom vi demonstreret brugen af denne teknik med vores lys skader model, kunne det sandsynligvis blive brugt til at studere regenerering i andre skader modeller 2-8 eller bruges til at undersøge funktionen af proteiner i ubeskadiget nethinden. For eksempel kunne elektroporation af morpholinos bruges til at Knockdown udtryk for bestemte kanaler eller signaltransduktion molekyler i ganglion eller amacrine celler og derefter studere funktionen af ​​disse signaleringveje i visuel bearbejdning. Men da morpholinos kun påvirke oversættelse af nye protein, ville man være nødt til at vente, indtil endogene protein omsætningen sker, før en analyse kunne udføres. Afhængigt af stabiliteten af det protein, kan der spænder fra timer til dage 18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> CUY21-EDIT eller CUY21-SC firkantbølge electroporator </td><td> Protech International </td><td> CUY21EDIT eller CUY21SC </td><td> Begge enheder arbejder for denne protokol </td></tr><tr><td> 3-mm diameter padle elektroder </td><td> Protech International </td><td> CUY 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morpholino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morpholino skal special designet til din protein af interesse </td></tr><tr><td> 2-Phenoxyethanol </td><td> Sigma </td><td> 77861-1L </td><td> Anæstesi, fortyndes 1:1000 i fisk systemet vand for procedure, 1:500 for eutanasi </td></tr><tr><td> Dumont # 5 pincet </td><td> Verdens præcisionsinstrumenter </td><td>14095 </td><td> Enhver # 5 pincet med arbejde </td></tr><tr><td> Dumont # 5B pincet med vinklet tips </td><td> Verdens præcisionsinstrumenter </td><td> 500234 </td><td> Bruges til at enucleate øje følgende eutanasi </td></tr><tr><td> Sapphire klinge, dobbelt kant Lance, 1 mm brede, med Sapphire kniv håndtag </td><td> Verdens præcisionsinstrumenter </td><td> Blade: 500314 Håndtag: 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton sprøjte med aftageligt 33 gauge stump ende nål </td><td> Hamilton firma </td><td> Sprøjten: 87930 Needle: 7762-06 </td><td> Fjern nålen, der kommer med sprøjte og erstatte med 33-gauge stump-end nål </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina

Mange ødelæggende arvelige øjensygdomme resultere i gradvise og uigenkaldelige blindhed, fordi mennesker ikke kan regenerere døende eller syge nethinde neuroner. I modsætning hertil har den voksne zebrafisk nethinden den robuste evnen til spontant at regenerere alle neuronal klasse, der er tabt i en række forskellige beskadigelse af nethinden modeller, inklusive retinal punktere, kemiske ablation, koncentreret høj temperatur, og intense lysbehandling 1-8. Vores lab grundigt karakteriseret regenerering af fotoreceptorer følgende konstant intense lys behandling og indre retinale neuroner efter intravitreal ouabain injektion 2, 5, 9. I alle tilfælde, bosiddende Müller glia genindtræde på cellecyklus at producere neurale stamceller, som fortsætter med at formere sig og migrere til den rette retinale lag, hvor de differentiere sig til den mangelfulde neuroner. Vi er kendetegnet fem forskellige stadier under regenerering af lys-DamaGed nethinden, som blev fremhævet af specifikke cellulære respons. Vi har identificeret flere differentielt udtrykte gener på hvert trin i retinal regenerering af mRNA microarray analyse 10. Mange af disse gener er også kritisk for okulær udvikling. For at teste, hvilken rolle hver kandidat gen / protein i løbet af nethindeløsning regenerering, vi havde brug for at udvikle en metode til betinget begrænse udtryk for en kandidat protein kun på tidspunkter i løbet af regenerering af den voksne nethinden. Morpholino oligos er almindeligt anvendt til at studere tab af funktion af specifikke proteiner under udviklingen af zebrafisk, Xenopus, chick, mus, og tumorer i menneskelige implanteret 11-14. Disse ændrede oligos basepair med komplementære RNA-sekvens enten at spærre for splejsning eller oversættelse af målet RNA. Morpholinos er stabile i cellen og kan eliminere eller &quot;Knockout&quot; protein udtryk i tre til fem dage 12. Hervi beskriver en metode til effektivt at Knockdown target protein udtryk i den voksne zebrafisk nethinden. Denne metode benytter Lissamin-tagget antisense morpholinos, der sprøjtes ind i glaslegeme af den voksne zebrafisk øjet. Brug elektrode pincet, er morpholino så electroporated i alle celletyper i ryg og centrale nethinden. Lissamin giver afgiften på de morpholino for elektroporation, og kan visualiseres at vurdere tilstedeværelsen af ​​morpholino i retinal celler. Betinget Knockdown i nethinden kan bruges til at undersøge, hvilken rolle specifikke proteiner på forskellige tidspunkter i løbet af regenerering. Derudover kan denne metode bruges til at studere betydningen af ​​specifikke proteiner i ubeskadiget nethinden, i sådanne processer som visuel transduktion og visuel forarbejdning i anden ordens neuroner.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina at JoVE.com

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

En metode til betinget Knockdown et mål protein udtryk i den voksne zebrafisk nethinden er beskrevet, hvilket indebærer intravitrealt injektion antisense morpholinos og electroporating dem ind i nethinden. Den resulterende protein er slået ned i flere dage, hvilket giver mulighed for test af protein rolle i regenerere eller intakte nethinden.

In vivo Elektroporation af Morpholinos i den voksne zebrafisk Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo elektroporation af Morpholinos i Regenerating Adult zebrafisk Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...