Name: in vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina
Uploaded: 2011-12-27T12:00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina at JoVE.com

De auteurs willen graag de Freimann Life Science Center en Center bedanken voor de zebravis Onderzoek medewerkers voor hun verzorging en het onderhoud van de zebravis.

1. Morfolino voorbereiding: <ol><li> Alle morfolino oligo moet worden op maat ontworpen en besteld via GeneTools (Philomath, OR). We maken gebruik van de positief geladen lissaminegroen-gelabeld morpholinos aan de geëlektroporeerde morpholinos de richting van de negatieve elektrode schijf. We hebben geprobeerd, zonder succes, tot negatief geladen fluoresceïne-gelabeld morpholinos te richten op de positieve elektrode met deze techniek. Verdunnen 300 nmol van morfolino in 100 ul nuclease-vrij water tot een 3 mM oplossing opleveren. Aliquot de morfolino in meerdere paraffine afgesloten microcentrifugebuizen. Bewaar uit de buurt van het licht bij kamertemperatuur. </li><li> Bepaal de morfolino-concentratie door het verdunnen van 5 pi van morfolino-(of water wordt gebruikt om de morfolino als een blanco verdund) in 95 pi van 0,1 N HCl. Stel de spectrofotometer golflengte (λ) tot 265 nm. Bereken de constante voor uw morfolino met behulp van de volgende vergelijking: Constant = moleculair gewicht vooral op uw morfolineo X 1000/molar absorptie. </li><li> U vindt het moleculair gewicht en de molaire extinctie gegevens op de &quot;Oligo Properties&quot; plaat die bij elke morfolino. Analyseer de leeg om baseline metingen te controleren en te nemen lezingen van elk verdund morfolino. Vermenigvuldig de absorptie bij 265 nm van elk morfolino door haar vastgestelde constante en door de verdunningsfactor om de concentratie in ng / ul te krijgen. Deel dit getal door het molecuulgewicht om de concentratie in mM te bepalen. Verdun de morfolino, indien nodig, een werkende concentratie. </li></ol> 2. Verwijder de buitenste hoornlaag: <ol><li> Verdoven 6-12 maanden oude volwassen zebravissen in tricaïne of 2-fenoxyethanol op 1,0 mg / ml in de zebravis tank water. </li><li> Wikkel zebravis in een vochtig stuk keukenpapier, die de kieuwen, maar het verlaten van de ogen blootgesteld. De verpakte vis wordt geplaatst onder een stereoscoop en de vergroting is verhoogd totdat de diameter van het oog vult ongeveer een derde van dehet gezichtsveld (figuur 1). </li><li> Met behulp van Dumont # 5 pincet, pak de buitenste hoornvlies in de buurt van de optische spleet. Dit weefsel is gekleurd in het rood en is het label &quot;OC&quot; in figuur 1. Er is een kleine uitstulping of lip door de pijl aangegeven met het label &quot;CL&quot;. Trek in een lage hoek (dat wil zeggen 10 graden) over het oog naar de buitenste hoornvlies te verwijderen. Met de praktijk kan dit worden ingevuld in een beweging. Als de pincet slip, re-pak het weefsel en weer trekken op een lage hoek totdat verwijderd. Een goed aangesloten hoornvlies kan het oog te worden verdreven uit het stopcontact wanneer getrokken. U kunt de ogen van steeds verdreven door stil houden met een andere set van een pincet. </li></ol> 3. Cornea incisie en morfolino injectie: <ol><li> Onmiddellijk na het verwijderen van de buitenste hoornvlies, maak een kleine incisie in het hoornvlies, waar de leerling voldoet aan de iris (figuur 2). Dit wordt gedaan met behulp van een saffier mes scalpel (zie Materials). </li><li> Belasting 0,5 ul van de 3,0 mM morfolino-oplossing in een Hamiltop de injectiespuit met een 33 meter verwijderbare, stompe naald-end (zie Materials). Pipet omhoog en omlaag om luchtbellen te verwijderen in de lijn. Steek de naald in het glasvocht via de incisie (figuur 2). Geen steek de naald te ver of je zal doorboren het netvlies of verplaatsen van de lens. </li><li> Injecteer langzaam de morfolino-oplossing in het vitreale ruimte. Afhankelijk van de leeftijd van de vis, zal de vitreale ruimte te houden ~ 0,5 ul. Je moet visualiseren ongekleurd glasachtig lichaam lekt uit de incisie als het wordt verplaatst door de morfolino oplossing. Injecteren totdat er een kleine hoeveelheid van morfolino-oplossing lekt uit de incisie. Je moet een duidelijk beeld van de lissaminegroen-tag morfolino in het oog. </li><li> Na de injectie, de terugkeer van de vis aan de bak om te herstellen. We meestal alleen injecteren het linkeroog, met behulp van het rechter oog als een uninjected controle, maar elektroporatie van beide ogen is mogelijk. </li></ol> 4. Elektroporatie: <ol><li> Volgendede injectie van ongeveer 10 vissen, opnieuw verdoven een geïnjecteerde vissen en wikkel het in een vochtig stuk keukenrol, net voor de kieuwen, maar het verlaten van de ogen blootgesteld. Breng de vis op een petrischaal. Zet op latex of vergelijkbare handschoenen om de blootstelling aan de narcose te voorkomen. Terwijl zachtjes Houd de vis aan de bodem van de schaal, vul de schaal met anesthesie (Figuur 3, links paneel). </li><li> Een 3-mm-diameter van platina plaat elektrode (zie Materiaal) lokaliseert de elektroporatie pulsen tot ongeveer de helft van het netvlies. We meestal gericht zijn op de dorsale netvlies. Voorzichtig naar beneden drukt u op de positieve elektrode aan de ventrale helft van het oog. Met de buitenste hoornvlies verwijderd, wordt het oog gemakkelijk gedraaid, waardoor de dorsale deel van de oogbol. </li><li> Hoewel nog steeds naar beneden te drukken aan de ventrale zijde van het oog, plaats de negatieve elektrode in de buurt (~ 1 - 2 mm) van de blootgestelde dorsale helft van het oog. Wees voorzichtig dat u de negatieve elektrode direct raken aan het oog, wat zal resulteren in schade aande dorsale netvlies. Zodra je de juiste afstand tussen de elektroden, gebruik dan de stelschroef op het handvat van de elektroden die zich verspreiden handhaven bij electroporating. Dit houdt de negatieve elektrode een optimale afstand van de oogbol als de positieve elektrode wordt ingedrukt houden in de stand. </li><li> Electroporate het oog met behulp van een CUY21 Square Wave Electroporator (zie Materials). De elektroporatie parameters moeten worden ingesteld op twee opeenvolgende pulsen van 50 ms, op 75 V met een 1-sec pauze tussen de pulsen. </li><li> Keer terug vis aan de tank. We beginnen meestal ons protocol voor een constante licht-geïnduceerde retina degeneratie onmiddellijk na elektroporatie. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: <ol><li> Gedurende 3-5 dagen na de elektroporatie (afhankelijk van de stabiliteit van de morfolino), kan de lissaminegroen etiket gevisualiseerd worden in alle de retinale lagen in een doorsnede retina (figuur 4). Dit dient als een bevestiging voor de aanwezigheid vande gelabelde morfolino. </li><li> We kunnen bereiken vol proteïne knockdown tot 3-5 dagen na elektroporatie, afhankelijk van de effectiviteit van de morfolino-(figuur 5). Typisch, tijdens de lichtbehandeling studies, oogsten we de ogen op 3 of 4 dagen na morfolino elektroporatie. Dit wordt gedaan door het verwijderen van de gehele oog met Dumont # 5B pincet met gebogen uiteinden (Figuur 6, Materials) en de verwerking van het weefsel voor immunohistochemie 15. Net als bij elke knockdown techniek, moet een demonstratie van efficiënte knock-down worden getoond om het fenotype te valideren. Daarom stellen we voor het verkrijgen van antisera voor uw eiwit van belang. Als alternatief, indien en antilichaam niet beschikbaar is en de morfolino is gericht op de splice acceptor of de donor site in het pre-mRNA ofwel, zal het blok efficiënt splicing van het mRNA. In dit geval, is het mogelijk om reverse transcriptase-PCR te gebruiken om de flankerende sequenties in de morphant RNA versterken en de efficiëntie van het blokkeren van de normale splic vast te stellenING patroon. </li><li> Wanneer de netvliezen zijn doorsnede van de neus tot de tijd op de rug ventrale as, de gearceerde blauwe dozen (Figuur 6) vormen de gebieden van het netvlies die het meest vaak beschadigd uit de elektroporatie evenement zelf. Het gearceerde roze doos staat voor het gebied dat bedoeld is voor morfolino introductie in retinale cellen door de elektroporatie. </li></ol><img alt="Figuur 1." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische voorstelling van de verwijdering van de epitheliale lagen van het hoornvlies. Het linker paneel toont de belangrijkste structurele kenmerken van het oog, met inbegrip van de lens (L), het glasvocht (Vit), het netvlies (R), de buitenste hoornvlies (OC), de binnenste hoornvlies (IC) en het hoornvlies uitsteeksel ( CL). De oriëntatie van het oog is te zien in de rechter benedenhoek van het eerste paneel en is gelabeld anterior (A), posterior (P), rug (D), en ventrale (V). De rode kleur geeft aan de buitenste hoornvlies dat wordt verwijderd. De tweede pan<html> el laat zien hoe de tang worden gebruikt om het hoornvlies uitsteeksel vatten en aan de buitenste hoornvlies te trekken over het oog op een lage hoek (derde paneel). Het rechter paneel laat zien hoe een tweede paar tang kan gebruikt worden om stabiel in het oog terwijl u het hoornvlies. <img alt="Figuur 2." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig2.jpg" /> Figuur 2. Schematische voorstelling van de stappen die betrokken zijn bij de intravitreale injectie van morfolino. Een kleine incisie wordt gemaakt in het oog waar de pupil aan de iris (linker paneel). Het resulterende gat moet net groot genoeg voor een 33 gauge naald, die is gevuld met de morfolino oplossing, op te nemen (middelste paneel). Injecteer langzaam 0,5 ul van de oplossing in het glasvocht (rechter paneel). Je moet visualiseren een kleine hoeveelheid van vitreale oplossing komen uit de incisie als het glasvocht wordt gedeeltelijk vervangen door met lissaminegroen-tag morfolino (rechter paneel). ig3.jpg &quot;/&gt; Figuur 3. Schematische voorstelling van de algemene elektroporatie procedure. De verdoofde vissen, die intravitreally werd geïnjecteerd met de morfolino, is voorzichtig gewikkeld in een vochtige papieren doekje (linker paneel). De papieren handdoek moet betrekking hebben op de kieuwen, maar niet in de weg het oog (middelste paneel). Druk de positieve elektrode naar beneden op het ventrale deel van het oog, waardoor de dorsale helft van het oog naar buiten draaien van het stopcontact. Plaats de negatieve elektrode van ongeveer 1 mm van de dorsale helft van het oog en start de elektroporatie (rechter paneel). <img alt="Figuur 4." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig4.jpg" /> Figuur 4. Confocale image vergelijking van een netvlies geëlektroporeerd zonder intravitreally het injecteren van een lissaminegroen-gelabeld morfolino (A), en een netvlies intravitreally geïnjecteerd en geëlektroporeerd met de lissaminegroen-gemerkte morfolino (B). De lissaminegroen label is te vinden in alle lagen en de retinale celtypes. ROS, staaf buitenstesegmenten; ONL, buitenste nucleaire laag, INL, binnenste nucleaire laag; GCL, ganglion cellaag. <img alt="Figuur 5." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig5.jpg" /> Figuur 5. Confocale beelden vergelijken PCNA immunolocalization in netvlies geëlektroporeerd met een controle morfolino (links panelen) en het netvlies geëlektroporeerd met een anti-PCNA morfolino (rechts panelen) voorafgaand aan het licht-geïnduceerde fotoreceptorcel dood. Donker aangepaste volwassen albino zebravissen werden geplaatst in constant intens licht voor 1, 2 of 3 dagen na elektroporatie van de morfolino. De controle morfolino niet meer PCNA expressie onderdrukken in het licht-beschadigde netvliezen. De anti-PCNA morfolino efficiënt neergehaald PCNA eiwit expressie door middel van drie dagen van intens licht constant schade. <img alt="Figuur 6." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig6.jpg" /> Figuur 6. Schematisch (linker paneel) met enucleatie van het oog voor pEHANDELING en cryosectioning, die wordt gedaan aan de dorsale ventrale as. De roze gearceerde doos (rechter paneel) toont de retina regio met de grootste hoeveelheid proteïne knockdown met deze techniek. De blauwe grijze vakjes vormen gebieden die het meest vaak beschadigd door de elektroporatie gebeurtenis. De oriëntatie van het oog is het label anterior (A), posterior (P), rug (D), en ventrale (V).

<ol>
	<li>Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proneural+basic+helix-loop-helix+gene+ascl1a+is+required+for+retina+regeneration.">The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration.</a> J. Neurosci. 28, 1109-1117 (2008).</li><li>Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+inner+retinal+neurons+after+intravitreal+injection+of+ouabain+in+zebrafish.">Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish.</a> J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).</li><li>Hitchcock, P., Ochocinska, M., Sieh, A., Otteson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+injury-induced+neurogenesis+in+the+vertebrate+retina.">Persistent and injury-induced neurogenesis in the vertebrate retina.</a> Prog. Retin. Eye Res. 23, 183-194 (2004).</li><li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish.">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> B.M.C Dev. Biol. 6, 36-36 (2006).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).</li><li>Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-+and+dose-dependent+influence+of+ouabain+on+the+ultrastructure+of+optic+neurones.">Time- and dose-dependent influence of ouabain on the ultrastructure of optic neurones.</a> Cell Tissue Res. 164, 503-517 (1975).</li><li>Wu, D. M., Schneiderman, T., Burgett, J., Gokhale, P., Barthel, L., Raymond, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cones+regenerate+from+retinal+stem+cells+sequestered+in+the+inner+nuclear+layer+of+adult+goldfish+retina.">Cones regenerate from retinal stem cells sequestered in the inner nuclear layer of adult goldfish retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42, 2115-2124 (2001).</li><li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Muller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish.">Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li><li>Vihtelic, T. S., Soverly, J. E., Kassen, S. C., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+regional+differences+in+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+light-lesioned+albino+zebrafish.">Retinal regional differences in photoreceptor cell death and regeneration in light-lesioned albino zebrafish.</a> Exp. Eye Res. 82, 558-575 (2006).</li><li>Kassen, S. C., Ramanan, V., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Liu, C. G., Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+analysis+of+gene+expression+during+light-induced+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+albino+zebrafish.">Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).</li><li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo:+a+novel+antisense+approach.">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Dev. Biol. 222, 124-134 (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morpholino+phenocopy+of+the+mouse+mos+mutation.">A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation.</a> Genesis. 30, 198-200 (2001).</li><li>London, C. A., Sekhon, H. S., Arora, V., Stein, D. A., Iversen, P. L., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+antisense+inhibitor+of+MMP-9+attenuates+angiogenesis,+human+prostate+cancer+cell+invasion+and+tumorigenicity.">A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity.</a> Cancer Gene Ther. 10, 823-832 (2003).</li><li>Thummel, R., Kassen, S. C., Enright, J. M., Nelson, C. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Muller+glia+and+neuronal+progenitors+during+adult+zebrafish+retinal+regeneration.">Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration.</a> Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).</li><li>Cameron, D. A., Gentile, K. L., Middleton, F. A., Yurco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+intact+and+regenerating+zebrafish+retina.">Gene expression profiles of intact and regenerating zebrafish retina.</a> Mol. Vis. 11, 775-791 (2005).</li><li>Craig, S. E., Thummel, R., Ahmed, H., Vasta, G. R., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+galectin+Drgal1-l2+is+expressed+by+proliferating+Muller+glia+and+photoreceptor+progenitors+and+regulates+the+regeneration+of+rod+photoreceptors.">The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 3244-3252 (2010).</li><li>Thummel, R., Enright, J. M., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Bailey, T. J., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6a+and+Pax6b+are+required+at+different+points+in+neuronal+progenitor+cell+proliferation+during+zebrafish+photoreceptor+regeneration.">Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration.</a> Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).</li><li>Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+glial+cell+division+blocks+regeneration+of+the+light-damaged+zebrafish+retina.">Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina.</a> Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).</li><li>Thummel, R., Bai, S., Sarras, M. P., Song, P., McDermott, J., Brewer, J., Perry, M., Zhang, X., Hyde, D. R., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fin+regeneration+using+in+vivo+electroporation+of+morpholinos+against+fgfr1+and+msxb.">Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb.</a> Dev. Dyn. 235, 336-346 (2006).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+excitability,+and+transfection+of+retinal+neurons+in+an+organotypic+culture+of+mature+zebrafish+retina.">Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina.</a> Cell Tissue Res. 332, 195-209 (2008).</li></ol>

We hebben niets te onthullen

Onlangs, twee microarray-analyses onderzocht de genexpressie veranderingen die zich hebben voorgedaan tijdens de regeneratie van zowel de licht-beschadigde netvlies of een chirurgisch-weggesneden netvlies patch 10, 16. Beide studies toonden een groot aantal genen die significante veranderingen tentoongesteld in expressie, hetzij verhogen of te verlagen, die waarschijnlijk nodig zijn voor verschillende gebeurtenissen die zich voordoen tijdens het netvlies regeneratie, zoals de re-entry van de Müller glia in de cel cyclus, voortgezet proliferatie en migratie van de neuronale voorlopercellen om de beschadigde netvlies laag, en de differentiatie van de neuronale voorlopercellen in de juiste neuronale cel type. Terwijl een directe vergelijking van deze twee microarray datasets laten zien kandidaat-genen die betrokken kunnen zijn bij deze cellulaire gebeurtenissen, uiteindelijk deze genen en hun gecodeerde eiwitten moeten worden getest om te bepalen of zij noodzakelijk zijn voor de neuronale regeneratie. Hier beschrijven we een krachtige verlies-van-functie benadering van de conditioNally knockdown eiwitten van belang in de volwassen zebravissen netvlies. Deze techniek is gebruikt om zowel de extracellulaire en intracellulaire eiwitten, evenals signaalmoleculen, transcriptiefactoren en eiwitten die nodig zijn voor replicatie van DNA 17-19 te bestuderen. Zo is deze methode zeer geholpen ons begrip van de moleculaire mechanisme dat ten grondslag volwassen netvlies regeneratie in de zebravis. We testten meerdere elektroporatie parameters (spanning, aantal pulsen, de tijd tussen de pulsen) voor een succesvolle protocol werd bereikt. Een eerdere rapport van electroporating morpholinos in de regeneratie van zebravis staartvin 10 pulsen gebruikt bij een lage spanning (15 V) 20. Omdat de volwassen zebravissen netvlies is omgeven door meerdere cellagen en is niet gemakkelijk toegankelijk voor pincet elektroden, de parameters die in het fin waren niet succesvol op een efficiënte electroporating morpholinos in de volwassen netvlies. Omgekeerd, een hoge spanning (100 V) vaak resulted in de dood van de vissen. Onlangs, 5 pulsen van 80 V werd beschreven om plasmide DNA electroporate in de pasgeboren muis pup netvlies 21. Wij vonden dat een iets minder intens 2 pulsen van 75 V resulteerde in de succesvolle elektroporatie van de morpholinos in de volwassen zebravissen netvlies met de overleving van 100% van de behandelde vis. Bovendien ontdekten we dat de verwijdering van de buitenste (of externe meest)-component van het hoornvlies sterk de elektroporatie efficiëntie verhoogd. Verhoging van het aantal pulsen kunnen elimineren de noodzaak voor het verwijderen van dit weefsel, maar kan ook leiden tot een grotere beschadiging van het weefsel. Uitgebreide controle studies hebben aangetoond dat deze parameters geen enkele betekenis netvlies celdood veroorzaken of wijziging van de specifieke cellulaire responsen waargenomen tijdens de afdrukband regeneratie 19. Gain-of-functie studies zijn momenteel niet mogelijk met behulp van deze techniek in vivo, als gevolg van ons onvermogen om consequent grote ribonucleïnezuren electroporate in alle retinal cellen. Echter, het succes van de electroporating plasmiden in de muis netvlies in vivo en de zebravis netvlies in explantaten doet vermoeden is het nog steeds een mogelijkheid in de zebravis 21, 22. Een van de sterke punten van deze techniek is de elektroporatie verschijnt op efficiënte wijze de morfolino introduceren in alle van de verschillende celtypes netvlies. Echter, een potentiële zwakte was dat de elektroporatie efficiënt de morfolino geleverd in alleen de dorsale en de centrale netvlies regio&#39;s. Een tweede elektroporatie gebeurtenis in de richting van de ventrale helft van het netvlies resulteert in goede richten naar alle lagen, maar leidt vaak tot schade. Deze ruimtelijke beperking waarschijnlijk was te wijten aan de vorm en plaatsing van de elektroden. Het gebruik van op maat ontworpen cup vorm van elektroden die kunnen worden geplaatst rond de ogen kan het verbeteren van deze zwakte. Deze ruimtelijke beperking van het morfolino-aflevering beperkt het gebruik van deze techniek en sluit het gebruik van een test such als ERG analyse dat een globale beoordeling van het netvlies zou vereisen. Opgemerkt dient te worden dat net als bij elke morfolino experiment, is het raadzaam om uw resultaten te bevestigen met behulp van een tweede, niet-overlappende morfolino naar het doel mRNA. In sommige gevallen is het mogelijk om ook tegelijkertijd electroporate twee verschillende morpholinos om knockdown de expressie van twee verschillende eiwitten. We hebben laten zien dit door kloppen beneden de expressie van zowel de Pax6a en Pax6b eiwitten, individueel en in combinatie 18. Hoewel we zien het gebruik van deze techniek met onze lichte schade model, zou het waarschijnlijk worden gebruikt om de regeneratie studie in andere schade modellen 2-8 of worden gebruikt om de functie van eiwitten in de onbeschadigde netvlies te onderzoeken. Kan bijvoorbeeld elektroporatie van morpholinos worden gebruikt om knockdown de expressie van specifieke kanalen of signaaltransductie moleculen in ganglion of amacrine cellen en vervolgens onderzoek naar de functie van deze signaleringpaden in visuele verwerking. Echter, zoals morpholinos slechts vertaling van nieuwe eiwitten beïnvloeden, zou men moeten wachten tot endogene eiwit omzet komt voor een test kon worden uitgevoerd. Afhankelijk van de stabiliteit van het eiwit, kan dat variëren van uren tot dagen 18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> CUY21-EDIT of CUY21-SC Plein wave electroporator </td><td> Protech International </td><td> CUY21EDIT of CUY21SC </td><td> Beide eenheden werken voor dit protocol </td></tr><tr><td> 3-mm diameter peddel elektroden </td><td> Protech International </td><td> CUY 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morfolino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morfolino moet op maat worden ontworpen om uw eiwit van belang </td></tr><tr><td> 2-Fenoxyethanol </td><td> Sigma </td><td> 77861-1L </td><td> Anesthesie, verdunnen 1:1000 in vis systeem water voor de procedure, 1:500 voor euthanasie </td></tr><tr><td> Dumont # 5 pincet </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td>14095 </td><td> Elke # 5 pincet met werk </td></tr><tr><td> Dumont # 5B pincet met gebogen tips </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> 500234 </td><td> Gebruikt om ophelderen oog na euthanasie </td></tr><tr><td> Sapphire blad, dubbele rand lans, 1 mm breed, met Sapphire mes handvat </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> Blade: 500314 Handgreep: 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton spuit met afneembare 33 meter stompe einde van de naald </td><td> Hamilton bedrijf </td><td> Spuit: 87930 Naald: 7762-06 </td><td> Verwijder de naald die wordt geleverd met spuit en te vervangen door 33-gauge stompe naald-end </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina

Veel verwoestende erfelijke oogziekten leiden tot een progressieve en onomkeerbare blindheid omdat mensen niet kunnen regenereren sterven of ziek netvlies neuronen. In tegenstelling tot de volwassen zebravissen netvlies bezit de robuuste mogelijkheid om spontaan te regenereren alle neuronale klasse die verloren gaat in een verscheidenheid van verschillende schade aan het netvlies modellen, inclusief retinale doorboren, chemische ablatie, geconcentreerd hoge temperatuur, en het intense licht behandeling 1-8. Ons laboratorium uitvoerig gekarakteriseerd regeneratie van de fotoreceptoren volgende constant fel licht de behandeling en de binnenste netvlies neuronen na intravitreale ouabain injectie 2, 5, 9. In alle gevallen, resident Müller glia opnieuw in te voeren de cel cyclus om neuronale voorlopercellen, die verder te laten groeien en migreren naar de juiste netvlies laag, waar ze differentiëren tot de gebrekkige neuronen produceren. We hebben vijf verschillende stadia gekenmerkt tijdens de regeneratie van de licht-damaGed retina die werden benadrukt door specifieke cellulaire reacties. We hebben verschillende differentieel tot expressie genen geïdentificeerd in elke fase van het netvlies regeneratie door mRNA microarray analyse 10. Veel van deze genen zijn ook kritisch voor oculaire ontwikkeling. Voor het testen van de rol van elke kandidaat-gen / eiwit tijdens het netvlies regeneratie, moesten we een methode om de expressie van een kandidaat-eiwit voorwaardelijk te beperken alleen in tijden tijdens de regeneratie van de volwassen netvlies te ontwikkelen. Morfolino oligo&#39;s worden op grote schaal gebruikt voor het verlies van functie van specifieke eiwitten te bestuderen tijdens de ontwikkeling van de zebravis, Xenopus, kuiken, muis, en tumoren in het menselijk xenotransplantaten 11-14. Deze gemodificeerde oligo basenparen met complementaire RNA-sequentie ofwel blokkeren van de splicing of vertaling van het doelwit RNA. Morpholinos zijn stabiel in de cel en kunnen elimineren of &quot;knockdown&quot; eiwitexpressie gedurende drie tot vijf dagen 12. Hier,beschrijven we een methode om efficiënt knockdown doelwit proteïne-expressie in de volwassen zebravissen netvlies. Deze methode maakt gebruik van lissaminegroen-tagged antisense morpholinos die worden geïnjecteerd in het glasachtig lichaam van de volwassen zebravissen oog. Met behulp van elektrode tang, is de morfolino dan geëlektroporeerd in alle celtypen van het dorsale en centrale netvlies. Lissaminegroen levert de lading op de morfolino voor elektroporatie en kunnen worden gevisualiseerd om de aanwezigheid van de morfolino-beoordelen in de retinale cellen. Voorwaardelijke knockdown in het netvlies kan worden gebruikt om de rol van specifieke eiwitten te onderzoeken op verschillende momenten tijdens de regeneratie. Bovendien kan deze aanpak worden gebruikt om de rol van specifieke eiwitten in het netvlies onbeschadigd, in dergelijke processen als visuele transductie en visuele verwerking in tweede orde neuronen te bestuderen.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina at JoVE.com

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Een methode om een ​​doelwit eiwit expressie voorwaardelijk knockdown in de volwassen zebravissen netvlies wordt beschreven, wat inhoudt intravitreally injecteren van antisense morpholinos en electroporating ze in het netvlies. De daaruit resulterende eiwitten neergeslagen voor meerdere dagen, waardoor het testen van de eiwit rol in de regenereren of intact netvlies.

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in de Adult zebravis Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Transplantatie van Whole nier Marrow in Adult zebravis

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypische Cultuur van Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single Cell Elektroporatie in vivo binnen de Intact ontwikkeling van de hersenen

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Retro-orbitale injectie in Adult zebravis

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissectie van organen van de Adult zebravis

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Intraperitoneale injectie in de Adult zebravis

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

Directe levering van MAV Morpholinos Into the zebravis Otocyst door injectie en elektroporatie van invloed op binnenoor Ontwikkeling

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Transplantatie van cellen direct in de nieren van Volwassen zebravis

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Dissectie van de Adult zebravis Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in het regenereren van Adult Zebravissen Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...