Name: in vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina
Uploaded: 2011-12-27T12:00:00
Duration: 6 min 55 s
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लेखकों Zebrafish अनुसंधान कर्मचारियों के लिए उनके और zebrafish की देखभाल और रखरखाव के लिए Freimann जीवन विज्ञान केंद्र और केंद्र धन्यवाद देना चाहूंगा.

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	<li>Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proneural+basic+helix-loop-helix+gene+ascl1a+is+required+for+retina+regeneration.">The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration.</a> J. Neurosci. 28, 1109-1117 (2008).</li><li>Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+inner+retinal+neurons+after+intravitreal+injection+of+ouabain+in+zebrafish.">Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish.</a> J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).</li><li>Hitchcock, P., Ochocinska, M., Sieh, A., Otteson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+injury-induced+neurogenesis+in+the+vertebrate+retina.">Persistent and injury-induced neurogenesis in the vertebrate retina.</a> Prog. Retin. Eye Res. 23, 183-194 (2004).</li><li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish.">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> B.M.C Dev. Biol. 6, 36-36 (2006).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).</li><li>Wolburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-+and+dose-dependent+influence+of+ouabain+on+the+ultrastructure+of+optic+neurones.">Time- and dose-dependent influence of ouabain on the ultrastructure of optic neurones.</a> Cell Tissue Res. 164, 503-517 (1975).</li><li>Wu, D. M., Schneiderman, T., Burgett, J., Gokhale, P., Barthel, L., Raymond, P. 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Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).</li><li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo:+a+novel+antisense+approach.">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Dev. Biol. 222, 124-134 (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Muller+glia+and+neuronal+progenitors+during+adult+zebrafish+retinal+regeneration.">Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration.</a> Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).</li><li>Cameron, D. A., Gentile, K. L., Middleton, F. A., Yurco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+intact+and+regenerating+zebrafish+retina.">Gene expression profiles of intact and regenerating zebrafish retina.</a> Mol. Vis. 11, 775-791 (2005).</li><li>Craig, S. E., Thummel, R., Ahmed, H., Vasta, G. R., Hyde, D. R., Hitchcock, P. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6a+and+Pax6b+are+required+at+different+points+in+neuronal+progenitor+cell+proliferation+during+zebrafish+photoreceptor+regeneration.">Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration.</a> Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).</li><li>Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Muller+glial+cell+division+blocks+regeneration+of+the+light-damaged+zebrafish+retina.">Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina.</a> Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).</li><li>Thummel, R., Bai, S., Sarras, M. P., Song, P., McDermott, J., Brewer, J., Perry, M., Zhang, X., Hyde, D. R., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fin+regeneration+using+in+vivo+electroporation+of+morpholinos+against+fgfr1+and+msxb.">Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb.</a> Dev. Dyn. 235, 336-346 (2006).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival,+excitability,+and+transfection+of+retinal+neurons+in+an+organotypic+culture+of+mature+zebrafish+retina.">Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina.</a> Cell Tissue Res. 332, 195-209 (2008).</li></ol>

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है

हाल ही में, दो माइक्रोएरे विश्लेषण जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन है कि या तो क्षतिग्रस्त रेटिना प्रकाश या एक शल्य चिकित्सा - excised रेटिना पैच 10, 16 के उत्थान के दौरान हुई जांच की. दोनों अध्ययनों से कई जीनों से पता चला है कि अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण बदलाव का प्रदर्शन किया, या तो बढ़ाने या कम है, की संभावना है कि अलग सेल चक्र में मुलर glia के पुनः प्रवेश के जैसे कि रेटिना उत्थान के दौरान होने की घटनाओं, के लिए आवश्यक हैं है, के प्रसार के प्रवास जारी रखा क्षतिग्रस्त रेटिना परत है, और सही neuronal सेल प्रकार में neuronal progenitors भेदभाव neuronal progenitors. जबकि इन दो माइक्रोएरे डेटा सेट के एक प्रत्यक्ष तुलना उम्मीदवार जीन है कि इन सेलुलर घटनाओं में शामिल हो सकता है पता चलता है, अंत में इन जीनों और उनके इनकोडिंग प्रोटीन निर्धारित करने के लिए अगर वे neuronal उत्थान के लिए आवश्यक हैं परीक्षण किया जाना चाहिए. यहाँ, हम conditio के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण हानि के समारोह का वर्णनnally वयस्क zebrafish रेटिना में ब्याज की पछाड़ना प्रोटीन. इस तकनीक को दोनों बाह्य और intracellular प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संकेतन अणुओं, प्रतिलेखन कारकों और डीएनए प्रतिकृति 17-19 के लिए आवश्यक प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस प्रकार, इस पद्धति बहुत आणविक zebrafish में वयस्क रेटिना उत्थान अंतर्निहित तंत्र के बारे में हमारी समझ सहायता प्राप्त है. हम कई electroporation पैरामीटर के पहले एक सफल प्रोटोकॉल हासिल की थी (दालों की वोल्टेज, दालों के बीच समय) का परीक्षण किया. Regenerating zebrafish दुम का पंख में morpholinos electroporating के पिछले एक रिपोर्ट एक कम वोल्टेज (15 वी) 20 पर 10 दालों का इस्तेमाल किया. क्योंकि वयस्क zebrafish रेटिना एकाधिक सेल परतों द्वारा घिरा हुआ है और आसानी से चिमटी से नोचना इलेक्ट्रोड सुलभ नहीं है, गतिविधियों में इस्तेमाल मापदंडों कुशलतापूर्वक वयस्क रेटिना में morpholinos electroporating में असफल रहे थे. इसके विपरीत, एक उच्च वोल्टेज (100 वी) अक्सर Res केमछली को मौत में ulted. हाल ही में, 80 के 5 दालों वी नवजात माउस पिल्ला 21 रेटिना में प्लास्मिड डीएनए electroporate वर्णित किया गया था. हमने पाया कि 75 साल की है कि एक से थोड़ा कम तीव्र 2 दालों वी इलाज मछली की 100% के अस्तित्व के साथ वयस्क zebrafish रेटिना में morpholinos के सफल electroporation में हुई. इसके अतिरिक्त, हम पता चला है कि बाहरी (या बाह्य सबसे) कॉर्निया के घटक सबसे हटाने बहुत electroporation दक्षता में वृद्धि हुई. दालों की संख्या बढ़ाने से इस ऊतक को हटाने के लिए समाप्त करने की जरूरत है, लेकिन यह भी अधिक से अधिक ऊतकों को नुकसान का कारण हो सकता है. व्यापक नियंत्रण के अध्ययन दिखा दिया है कि इन मानकों को किसी भी महत्वपूर्ण रेटिना कोशिका मृत्यु का कारण नहीं किया है या विशिष्ट सेलुलर प्रतिक्रियाओं बदल फोटोरिसेप्टर 19 उत्थान के दौरान मनाया. लाभ के समारोह अध्ययन वर्तमान में संभव नहीं हैं vivo में इस तकनीक, हमारी असमर्थता के कारण का उपयोग करने के लिए लगातार सभी r में बड़े ribonucleic एसिड electroporateetinal कोशिकाओं. हालांकि, vivo में माउस और explants में zebrafish रेटिना रेटिना में plasmids electroporating की सफलता से पता चलता है, यह अभी भी zebrafish 21, 22 में एक संभावना है. इस तकनीक की ताकत है electroporation कुशलता से अलग रेटिना सेल प्रकार के सभी में morpholino परिचय होता है. हालांकि, एक संभावित कमजोरी थी कि electroporation कुशलता केवल पृष्ठीय और केंद्रीय रेटिना क्षेत्रों में morpholino वितरित. सभी परतों के लिए अच्छा लक्ष्यीकरण में रेटिना परिणामों के वेंट्रल छमाही की ओर एक दूसरे electroporation घटना है, लेकिन नुकसान में अक्सर परिणाम. यह स्थानिक प्रतिबंध की संभावना इलेक्ट्रोड के आकार और प्लेसमेंट के लिए कारण था. कस्टम डिजाइन कप आकार इलेक्ट्रोड है कि आँख के आसपास रखा जा सकता है है का उपयोग इस कमजोरी को सुधार सकता है. Morpholino डिलीवरी की यह स्थानिक प्रतिबंध इस तकनीक का उपयोग सीमा है और एक परख सफलता का उपयोग precludesएर्ग विश्लेषण के रूप में ज है कि रेटिना के एक वैश्विक मूल्यांकन की आवश्यकता होगी. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि किसी भी morpholino के साथ प्रयोग के रूप में, यह सलाह दी जाती है के लिए अपने परिणामों की पुष्टि लक्ष्य mRNA के लिए एक दूसरे, गैर अतिव्यापी morpholino का उपयोग करना चाहिए. कुछ मामलों में, यह संभव है भी एक साथ दो अलग morpholinos पछाड़ना के लिए दो अलग अलग प्रोटीन की अभिव्यक्ति electroporate. हम नीचे दोनों Pax6a और Pax6b प्रोटीन की अभिव्यक्ति दस्तक, व्यक्तिगत और संयोजन में 18 के द्वारा इस का प्रदर्शन किया . हालांकि हम हमारे प्रकाश नुकसान मॉडल के साथ इस तकनीक के उपयोग का प्रदर्शन किया है, यह संभावना अन्य नुकसान 2-8 मॉडल में उत्थान अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या undamaged रेटिना में प्रोटीन के समारोह की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया. उदाहरण के लिए, morpholinos की electroporation नाड़ीग्रन्थि या लंबे प्रबर्धों से रहित कोशिकाओं में विशिष्ट या चैनलों संकेत पारगमन अणुओं की अभिव्यक्ति पछाड़ना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और फिर इन संकेतन के समारोह का अध्ययनरास्ते में दृश्य प्रसंस्करण. हालांकि, के रूप में morpholinos केवल नए प्रोटीन का अनुवाद को प्रभावित, एक के लिए प्रतीक्षा करने के लिए जब तक अंतर्जात प्रोटीन कारोबार होता है पहले एक परख प्रदर्शन किया जा सकता होगा. प्रोटीन की स्थिरता पर निर्भर करता है, कि घंटे से 18 दिनों के लिए रेंज कर सकते हैं.

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td> टिप्पणियाँ </td></tr><tr><td> CUY21 संपादित करें या CUY21 अनुसूचित जाति स्क्वायर लहर electroporator </td><td> प्रोटेक इंटरनेशनल </td><td> CUY21EDIT या CUY21SC </td><td> दोनों इकाइयों इस प्रोटोकॉल के लिए काम करते हैं </td></tr><tr><td> 3 मिमी व्यास चप्पू इलेक्ट्रोड </td><td> प्रोटेक इंटरनेशनल </td><td> 650 - पी 3 CUY </td><td></td></tr><tr><td> Morpholino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morpholino कस्टम ब्याज की अपने प्रोटीन के लिए डिजाइन किया जाना चाहिए </td></tr><tr><td> 2 - Phenoxyethanol </td><td> सिग्मा </td><td> +७७८६१-1L </td><td> संज्ञाहरण, पतला प्रक्रिया के लिए मछली सिस्टम पानी में 1:1000, 1:500 इच्छामृत्यु के लिए </td></tr><tr><td> # 5 चिमटी Dumont </td><td> विश्व परिशुद्धता उपकरण </td><td>14095 </td><td> काम के साथ कोई भी # 5 चिमटी </td></tr><tr><td> Angled सुझावों के साथ Dumont # 5B चिमटी </td><td> विश्व परिशुद्धता उपकरण </td><td> 500234 </td><td> स्पष्टीकरण करना आंख निम्नलिखित इच्छामृत्यु के लिए प्रयुक्त </td></tr><tr><td> नीलम ब्लेड, डबल बढ़त लांस, नीलम चाकू संभाल के साथ एक मिमी चौड़े, </td><td> विश्व परिशुद्धता उपकरण </td><td> ब्लेड: 500314 हैंडल: 500317 </td><td></td></tr><tr><td> हैमिल्टन हटाने योग्य के साथ 33 गेज सुई कुंद अंत सिरिंज </td><td> हैमिल्टन कंपनी </td><td> सिरिंज: 87930 सुई: 7762-06 </td><td> सुई कि सिरिंज के साथ आता निकालें और 33 गेज सुई कुंद अंत के साथ जगह </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

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In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

एक सशर्त वयस्क zebrafish रेटिना में एक लक्ष्य प्रोटीन अभिव्यक्ति पछाड़ना वर्णित विधि है, जो intravitreally antisense morpholinos इंजेक्शन लगाने और उन्हें रेटिना में electroporating शामिल है. परिणामस्वरूप प्रोटीन कई दिनों, जो regenerating या बरकरार रेटिना में प्रोटीन की भूमिका के परीक्षण की अनुमति देता है के लिए नीचे खटखटाया है.

Morpholinos के vivo electroporation में वयस्क Zebrafish रेटिना में

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